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编辑：陈敏/ 主编：张大川、蒋羽鸽/ 学术顾问：寇兴然
【食品安全与检测】版主：张震/ 学术编辑 姜名荻
【食品新思路】Adv. Sci.（IF = 14.3）：开发一种Zr-MOF载体增强双模式生物传感平台，对猴痘病毒（MPXV）进行快速超灵敏检测
Advanced Science
●迄今为止，已有100多个国家和地区报告了90,000多例人类猴痘（Mpox）的阳性病例。目前，定量聚合酶链反应（Quantitative PCR, qPCR）通常用于诊断Mpox。然而，qPCR是一种多温控核酸扩增过程，耗时且需要昂贵的设备和熟练的技术人员，在某些资源有限的环境中无法获得。因此，对Mpox快速、低成本、方便的核酸检测策略的需求迅速增加。
南方医科大学皮肤病医院的廖玉辉研究员和杨斌教授团队近日在国际著名期刊Advanced Science（IF = 14.3）发表了文章 “Zr-MOF Carrier-Enhanced Dual-Mode Biosensing Platforms for Rapid and Sensitive Diagnosis of Mpox”。本文以氨基苯二甲酸锆金属有机骨架（Zr-MOF (UiO-66-NH2)）为载体，通过集成双层发光体和纳米酶，构建了一种基于比色和电化学发光（Electrochemiluminescence, ECL）信号增强双模式的新型纳米标签Ru@U6-Ru/Pt NPs，用于在不同场景中超灵敏检测猴痘病毒（MPXV）。本传感器不仅可以产生增强的ECL和比色信号，而且比常用的纳米标签具有更高的稳定性。
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成果介绍
（1）双模传感平台的建立和原理
在本研究中，MPXV被用作模型靶标建立比色和ECL双模测流分析平台（lateral flow assay, LFA）（图 1）。临床样本最初在95°C下加热5 min以释放核酸。对于基于比色Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA，在靶标存在的情况下，靶标首先被Ru@U6-Ru/Pt-DNA纳米探针捕获，通过Watson-Crick碱基配对形成纳米探针-靶标复合物。然后将复合物转移到测试条的样品垫上进行后续杂交。通过毛细管效应，复合物进一步被固定在T线上的测试DNA捕获，由于第二次DNA杂交反应形成夹心型复合物，导致Ru@U6-Ru/Pt NPs积累而形成清晰的棕色带。过量的纳米探针与C线上的对照DNA发生反应，出现第二条棕色带。在没有靶标的情况下，T线上不能生成夹心型复合物，只有Ru@U6-Ru/Pt-DNA纳米探针与C线上的对照DNA直接反应，因此只产生一条棕色带。在Ru@U6-Ru/Pt NPs过氧化物酶（POD）样活性的刺激下，将测试条浸入3-氨基-9-乙基咔唑（3-Amino-9-ethylcarbazole, AEC）和H2O2混合物中，进行迁移后比色信号放大。T线的比色信号强度因Ru@U6-Ru/Pt NPs上不溶性棕红色产物的催化沉积而大大放大，有效地传导和扩增了无法检测的靶标结合分子事件，从而提高了LFA的检测灵敏度。
图1. (A) Ru@U6-Ru/Pt作为双信号探针的合成示意图。(B) 基于比色增强Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA示意图。(C) 基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的ECL传感平台示意图
（2）基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA检测性能评估
在最优分析参数条件下，作者以MPXV为目标，通过测试不同浓度的合成标准MPXV ss-DNA（0-5 × 105 pm），研究了一般和比色增强LFA的检测性能。随着MPXV浓度的增加，T线的颜色逐渐加深，表明纳米酶催化沉积扩增不会改变浓度依赖性的定量关系（图2A、C）。催化前后LFA的vLOD比传统的基于AuNPs LFA低62.5倍和6.25 × 105倍。对于半定量分析，图2B、D得到信号放大前后的半LOD值（空白样品的相对比色强度加上三倍标准偏差）分别为95和0.06 pM。此外，通过分析其他正痘病毒（包括塔塔痘病毒、骆驼痘病毒、牛痘病毒、痘痘病毒和天花病毒）的几种合成标准ssDNA，研究了基于Ru@U6-Ru/PtNPs的LFA的特异性，如图2F所示，与空白对照和其他正痘病毒相比，基于普通和比色增强的Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA对MPXV均表现出强烈的信号响应，表明所提出的基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA在专门区分MPXV和其他正痘病毒方面具有很高的特异性。
图 2. 制备的基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA 测试条对MPXV检测的分析性能。
AEC催化扩增之前测试条对不同浓度 MPXV 的反应照片。(B) AEC催化扩增前T线强度的校准曲线。(C) AEC催化扩增之后测试条对不同浓度MPXV的反应照片。(D) AEC 催化扩增后T线强度的校准曲线。(E) AuNPs-LFA、基于一般Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA和基于比色增强Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA之间vLOD和灵敏度比较。(F) 基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA测试条的选择性。(G) 基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA测试条检测的热裂解样品与提取样品的相关性。(H) 基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA测试条检测不同提取样品的反应照片。(I) 使用基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA测试条从加标样品中回收MPXV的测试条定性结果。所有实验均重复进行三次。(J) 使用混淆矩阵评估基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA与标准qPCR相比的灵敏度和特异性。
（3）基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的ECL平台的分析评估
在最佳条件下，使用基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的ECL平台监测不同浓度（0-104 pm）的MPXV标准。随着MPXV ss-DNA浓度从10-4增加到104 pm，ECL强度逐渐增加。与现有的MPXV检测方法相比，基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的ECL平台显示出更低的LOD和更宽的线性范围以及最短的传感时间。此外，样品处理采用热裂解而不进行提取，使其易于使用且节省时间。当使用来自其他正痘病毒的五种合成标准ssDNA研究基于Ru@U6-Ru/Pt NP的ECL平台的特异性时，只有在103 pm对MPXV的检测产生了明显的ECL强度，而在104 pm对其他正痘病毒没有观察到明显的ECL强度，证明了ECL感应模式对MPXV具有良好的选择性。此外，基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的ECL平台用于监测加标唾液、尿液和血清样本中的MPXV。平均回收率（n = 3）为87.1-110.1%，在允许范围内，表明ECL传感模式对MPXV检测具有良好的准确性。
（4）双模传感平台的临床应用
为了验证所开发平台的可靠性和实用性，收集了50个临床样本（40个Mpo阳性样本和10个来自健康志愿者的Mpox阴性样本），并使用开发的基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的双模传感平台以及qPCR检测进行监测。带有病毒提取的qPCR需要大约2小时；相反，带有病毒裂解的双模传感平台需要时间少于15分钟。使用基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的普通LFA检测上述40 Mpox阳性样本，在T线上未见到明显条带。然而，使用基于比色增强的Ru@U6-Ru/Pt NPs的LFA检测到的T线上出现了弱条带，并且唾液样本的条带比从身体其他部位采集的条带更强，这表明信号放大对于临床使用是必要的。然后作者使用基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的ECL平台分析样品。所有Mpox阳性样本均观察到清晰的ECL信号，而Mpox阴性样本的ECL信号较弱，表明基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的ECL平台以100%的准确率正确识别了所有Mpox阳性和Mpox阴性样本。本文提出的基于Ru@U6-Ru/Pt NPs的比色增强LFA和ECL平台的结果与所有50个临床样本的qPCR结果100%一致，表明开发的双模传感平台可以作为传统qPCR的替代方案，用于快速准确地检测MPXV。
● 创新性/应用前景
本文新发明的Ru@U6- Ru/Pt NPs双模式纳米传感平台可以在15分钟内实现对 MPXV核酸的快速筛选和定量分析，优于以前报道的MPXV或其他核酸靶标的传感平台，具有使用方便、省时、适合现场使用等优点。该传感方法也可作为快速监测其他病毒或者细菌的经济实惠、用户友好的工具。双模传感平台不仅优势互补，还能进一步提高检测精度和传感范围，在传感探针开发中具有广阔的应用前景。而如何充分利用纳米材料的特性，高效构建多功能纳米材料以满足更多的需求，也是当前的研究热点和发展趋势。
参考文献
https://doi.org/10.1002/advs.202405848
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