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引用本文
赵思,肖江强,张晗,凃晶晶, 殷芹,诸葛宇征. 利福昔明对野百合碱相关肝窦阻塞综合征小鼠的疗效及其机制[J]. 中华肝脏病杂志,2024, 网络预发表.
DOI:10.3760/cma.j.cn501113-20240118-00035
摘 要
目的
探讨利福昔明处理对于野百合碱诱导的肝窦阻塞综合征（HSOS）小鼠的疗效及其可能机制。
方法
将24只雄性C57BL/6J小鼠分为3组，分别予以对照溶剂、野百合碱及利福昔明处理。通过苏木精-伊红染色观察肝脏和肠道组织病理学变化，比较3组小鼠肝脏指数、血清肝酶、炎症因子、凋亡因子的差异；比较3组小鼠肠道菌群及肠道紧密连接蛋白的差异。组间比较采用 t检验和单因素方差分析。
结果
利福昔明处理组小鼠肝脏组织病理学明显改善，血清学丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平分别为（559.04±89.42）U/L和（676.90±106.25）U/L，显著低于PA-HSOS模型组［（846.05±148.46）U/L和（953.87±58.10）U/L，P＜0.05］，同时伴有较低水平的凋亡细胞及炎症因子；此外，相较于PA-HSOS组，利福昔明处理组小鼠肠道菌群多样性升高（P<0.05），其Shannon指数分别为7.77±0.10和7.16±0.07，不同组别菌群存在明显差异；其中利福昔明组厚壁菌门丰度为39.58%±0.56%，显著高于模型组（24.25%±0.64%，P＜0.05），而拟杆菌门丰度为54.70%± 0.41%，显著低于模型组（70.92%±0.49%，P＜0.05）。同时经利福昔明干预后，肠道紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达较模型组有上升趋势，转录水平上也得到了验证（P＜0.05）。
结论
利福昔明能够减轻野百合碱所致HSOS小鼠的肝损伤，其机制可能是通过调节肠道菌群进而改善肠道屏障功能发挥作用。
正 文
肝窦阻塞综合征（hepatic sinusoidal obstruction syndrome，HSOS）既往又被称作为肝小静脉闭塞病（hepatic veno-occlusive disease，HVOD），是由各种原因作用于肝血窦、肝小静脉和小叶间静脉内皮细胞引起肝内淤血和窦性门静脉高压的一种血管性药物性肝损伤，临床主要表现为肝脏肿大、肝区疼痛、顽固性腹水及黄疸等 ［ 1 ］ 。国内HSOS的主要病因是摄入含吡咯生物碱（pyrrolizidine alkaloid，PA）的土三七、野百合等。PA-HSOS中“肝-肠轴”概念的提出，为预防和治疗PA-HSOS提供了新的研究方向 ［ 2 ］ 。
利福昔明作为一种不易被吸收的口服广谱抗生素，能够改变肠道菌群组成、改善炎症反应及调节肠道免疫，在临床上已用于治疗多种胃肠道及肝脏疾病，如肠易激综合征、艰难梭菌感染、肝性脑病和非酒精性脂肪肝等，具有良好的安全性 ［ 3 ］ 。而利福昔明在PA-HSOS中的疗效尚未可知，本研究旨在研究利福昔明对PA-HSOS小鼠肝脏、肠道及肠道菌群的变化，探讨利福昔明对PA-HSOS小鼠的治疗效果及其可能的作用机制，为今后的诊疗措施提供新的依据。
材料与方法
一、材料
本研究采用6～8周龄雄性C57BL/6J品系小鼠，体质量18～20 g，购自上海必凯科翼生物科技有限公司（许可证号：SCXK2018-0006）；野百合碱（monocrotaline，MCT）购自美国Sigma公司；利福昔明（rifaximin，Rfx）购自美国Med Chem Express（MCE）公司；兔抗B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl相关X蛋白（Bcl assaciated X protein，Bax）和紧密连接蛋白（Occludin）单克隆抗体均购自美国Abcam公司；大鼠抗胞质紧密黏连蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；鼠抗β-肌动蛋白（actin）单克隆抗体购自美国CST公司；粪便DNA提取试剂盒购自广州美基生物科技有限公司；全自动生化分析仪购自德国Siemens公司；荧光定量PCR仪器LightCycler96购自瑞士Roche公司。
二、实验动物模型建立、分组及处理
将24只小鼠饲养1周后随机分为3组，分别为对照组、PA-HSOS组和PA-HSOS+Rfx组，每组小鼠各8只。MCT溶液的配制采用酸碱滴定的方式进行，即先使用1.0 mmol/L的稀盐酸完全溶解MCT粉末，随后用1.0 mmol/L的氢氧化钠溶液进行滴定，直至pH呈7.0；Rfx溶液的配制采用等渗盐水制备成混悬液。所有溶液均现配现用。考虑到利福昔明短期内可能对肠道菌群的影响较小，我们构建了一个相对慢性的PA-HSOS小鼠模型，即PA-HSOS组按照500 mg/kg的MCT溶液进行灌胃处理，2次/周，分别在第1天和第4天进行灌胃，为期7 d；PA-HSOS+Rfx组则在MCT灌胃的基础上予以利福昔明120 mg/kg每天灌胃处理，为期7 d。1周后处死各组小鼠，留取眼球血、肝脏、结肠、粪便等供后续实验研究。本实验根据赫尔辛基宣言使用动物，获得南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准（2021AE01088）。
三、标本采集和处理
1. 血清学指标检测：收集各组小鼠眼球血，分离血清，采用全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。
2. 肝脏和肠道病理学检测：完整取出小鼠肝脏并称量，计算肝脏指数（肝脏湿质量/体质量×100%）。留取部分肝组织和近端结肠置于4%多聚甲醛固定，进行苏木精-伊红（HE）染色光镜下观察切片。
3. 阿利新蓝-过碘酸-雪夫（AB-PAS）染色：小鼠结肠石蜡切片置于65 ℃烘箱中烘烤1 h，随后进行脱蜡、水化，并参照AB-PAS染色实验步骤对结肠组织进行染色，自然晾干后显微镜下观察拍照。
4. 16Sr RNA序列分析：收集大约0.2 g粪便样本，提取细菌群体的总DNA，以细菌338F（5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）为引物扩增16Sr RNA基因的V3～V4区，随后通过纯化、文本建库、测序并基于参考数据库对其进行分类注释。
5. 蛋白质印迹法检测肝组织及肠道组织蛋白表达：取肝脏和肠道组织制备匀浆提取总蛋白并进行定量。依次加样、凝胶电泳、转膜和封闭，参考抗体说明书4 ℃过夜孵育第一抗体（Bax、Bcl-2、Occludin、ZO-1，1∶1 000），第2天室温孵育第二抗体（1∶5 000），加入化学发光试剂置于凝胶图像成像分析系统进行曝光拍照，应用Image J软件分析条带灰度值。
6. RT-qPCR检测肝组织炎性因子及肠道紧密连接蛋白表达水平：提取肝脏和肠道总mRNA，随后进行逆转录合成cDNA，以其为模板进行荧光定量PCR检测，Bax、Bcl-2、ZO-1、Occludin、白细胞介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-1β、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和趋化因子C-C-基元受体2（chemokine C-C-motif receptor 2，CCR2）基因引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成（ 表1 ）。
四、统计学方法
数据统计分析采用SPSS 24.0及GraphPad Prism 8软件，结果以均数±标准差（ x¯± s）表示，组间比较采用样本均数 t检验和单因素方差分析， P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、肝脏组织病理学及生物化学指标的比较
PA-HSOS组小鼠肝脏肿大、表面淤血，镜下可见肝小叶和肝索结构紊乱，肝血窦扩张、充血，中央静脉内皮细胞损伤，肝细胞凝固性坏死，并伴有炎性细胞的浸润；而在予以利福昔明干预后肝脏表面光滑，肝小叶结构较清楚，肝细胞坏死程度减轻（ 图1A ）。与对照组相比，PA-HSOS组小鼠的肝脏指数、血清ALT和AST水平明显升高，利福昔明处理后上述指标均不同程度降低，差异有统计学意义（P<0.05， 图1B ～D）。
二、肝脏凋亡情况及炎性因子比较
如 图2A ～C所示，模型组小鼠促凋亡因子Bax蛋白和mRNA表达显著高于对照组，而抗凋亡因子Bcl-2蛋白和mRNA表达显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；经利福昔明干预后Bax蛋白表达水平有下调趋势，但差异无统计学意义（P>0.05），而Bcl-2蛋白表达量上升，与模型组差异有统计学意义（P<0.05）。同时，与对照组相比，PA-HSOS组小鼠炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β和趋化因子MCP-1、CCR2 mRNA表达水平较高（P<0.05）；与PA-HSOS组相比，利福昔明组中IL-6、TNF-α、IL-1β、MCP-1和CCR2 mRNA表达水平显著下调（P<0.05， 图2D ）。
三、肠道组织病理学及肠道ZO-1和Occludin蛋白的比较
如 图3A 和 图3B 所示，对照组结肠组织形态正常，上皮细胞排列整齐，边界清晰，肠绒毛规整，而PA-HSOS组小鼠肠黏膜排列紊乱，上皮细胞坏死，可见炎性细胞浸润。AB-PAS染色产生了类似的结果，对照组的结肠覆盖着许多蓝色的黏蛋白，而PA-HSOS组糖蛋白含量显著减少。在予以利福昔明处理后，肠道黏膜结构相对完整，上皮细胞无明显肿胀和空泡，结肠表面附着的黏蛋白含量也较PA-HSOS组增加。如 图3C 和 图3D 所示，对照组小鼠结肠组织中ZO-1和Occludin蛋白表达水平较模型组显著升高（ P<0.05）；经利福昔明干预后，ZO-1和Occludin蛋白表达较模型组有上升趋势，但ZO-1在两组之间差异无统计学意义（ P>0.05）。而在mRNA水平上，予以利福昔明处理后的ZO-1和Occludin的表达较PA-HSOS组显著上升（ 图3E ）。
四、16 s RNA检测分析
1. 物种组成分析及多样性分析：为了清楚展示野百合碱对小鼠肠道菌群组成及丰富度的影响以及利福昔明给药后的变化，我们根据样本物种（如操作分类单元，operational taxonomic unit，OTU）组成相似性及重叠情况绘制维恩图（ 图4A ），每组各5只。3组共有的OTUs有1 411个，而每个组特有的OTUs数量则各不相同：对照组特有2 213个OTUs，PA-HSOS模型组特有767个OTUs，PA-HSOS+Rfx组特有1 438个OTUs。从 图4B 中可以看到，在菌群α多样性方面，与对照组相比，PA-HSOS组Shannon指数（7.16±0.07）和系统发育多样性指数（143.2±3.74）这两个指数均显著下降，差异有统计学意义（ P<0.05）；经利福昔明处理后，与PA-HSOS模型组相比，PA-HSOS+Rfx给药组Shannon指数（7.77±0.10， P<0.05）和系统发育多样性指数（156.60±10.32， P=0.026）这2个指数均显著上升。在β多样性研究中，我们采用距离算法weighted unifrac对种间进化关系和物种丰度进行综合分析。主坐标分析（principal CO．ordinates analysis，PCoA analysis）结果表明，3组小鼠的粪便样本距离较远，数据向两边分散，而组内粪便样本相对集中，提示3组之间的整体群落组成不同（ 图4C ）。
2. 物种差异分析：在门水平上，与对照组相比，PA-HSOS组中小鼠粪便拟杆菌门数量明显升高，厚壁菌门数量减少，差异有统计学意义（ P<0.05）。与模型组比较，利福昔明处理组中厚壁菌门数量显著增加，拟杆菌门数量降低，差异有统计学意义（ P<0.05， 表2 ）。
在科水平上，我们筛选了相对丰度在l％以上的菌科进行3组之间的菌群分析，PA-HSOS模型组小鼠的毛螺菌科、瘤胃球菌科、颤螺旋菌科和Gastranaerophilales科所占比例显著降低（ P<0.05），普雷沃氏菌科和Muribaculaceae科（ P<0.05）所占比例显著增加。与PA-HSOS组相比，PA-HSOS+Rfx给药组小鼠的毛螺菌科、瘤胃球菌科、颤螺旋菌科和Gastranaerophilales科（ P<0.05）所占比例显著增加，Muribaculaceae科所占比例显著降低（ P<0.05， 表3 ）。
在属水平上，与对照组相比，PA-HSOS组中小鼠粪便罗氏菌属、毛螺菌科_UCG-006、毛螺菌科NK4A136组、拟杆菌属、颤螺菌属、瘤胃球菌属、另枝菌属的相对丰度显著降低，而普雷沃氏菌属、Muribaculaceae、Erysipelatoclostridium、红蝽菌科_ UCG-002的数量显著增加，差异有统计学意义（ P<0.05）；在予以利福昔明处理后，罗氏菌属、毛螺菌科_UCG-006、毛螺菌科NK4A136组、颤螺菌属、瘤胃球菌属、另枝菌属的数量上调，拟杆菌属、普雷沃氏菌属、Muribaculaceae、Erysipelatoclostridium、红蝽菌科_UCG-002的数量减少，差异有统计学意义（ P<0.05， 表4 ）。
讨 论
随着生活方式的改变以及生活水平的提高，人们的健康意识逐渐增强，养生保健中草药如土三七等的应用也逐步增多，这也导致了PA-HSOS的发病率日益增高。近年来，关于PA-HSOS的基础研究多聚焦于吡咯生物碱对于肝脏的直接损伤作用，即肝脏的第一重损伤，主要集中在氧化应激、组织凋亡以及炎症反应这三个部分，针对以上作用机制的药物也曾被应用于临床，但疗效甚微 ［ 4 , 5 ］ 。目前，随着“南京共识”的提出，抗凝治疗和经颈静脉肝内门体分流术（transjugular intrahepatic portosystemic shunt，TIPS）阶梯治疗极大地改善了患者的预后 ［ 6 ］ 。最近有学者发现，除了肝窦内皮细胞的直接损伤，肠道菌群在PA-HSOS中发挥着重要作用，用抗生素调节肠道菌群结构成为有希望的PA-HSOS治疗方法之一 ［ 7 ］ 。
关于PA-HSOS中肠道微生物的报道 ［ 7 , 8 ］ 均提到PA-HSOS小鼠或者大鼠的菌群组成结构与健康对照组不同，HSOS小鼠的菌群多样性和丰富度较对照组显著降低，主要表现在有益细菌相对减少，潜在病原体相对增加；在门水平，PA-HSOS组小鼠拟杆菌门的丰度明显上升，而厚壁菌门所占比例下降，这与我们的研究结果相一致。因此，靶向肠道微生物群可能是改善PA-HSOS的一种新策略。
研究表明，利福昔明可以调节肠道微生态，抑制小肠中的细菌过度生长，并通过改变微生物的毒力来降低致病菌的活性，如产生肠毒素的大肠杆菌和志贺菌 ［ 9 ］ 。对于非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）患者，经利福昔明治疗后NASH患者的ALT、AST、炎症因子以及肝细胞脂肪变性等均得到了有效缓解，究其原因部分可归因于利福昔明治疗患者肠道双歧杆菌等有益菌群丰度的增加 ［ 10 ］ 。关于NASH的小鼠模型同样也证实了这一现象 ［ 11 ］ 。以上这些研究表明，利福昔明能够导致肠道以及肝脏疾病中肠道微生物组成的改变，从而延缓疾病的发生和发展。
本研究结果显示，利福昔明处理可显著抑制野百合碱诱导的小鼠肝细胞坏死、肝窦出血，降低血清ALT、AST及肝脏组织中的凋亡分子和炎性因子。而在肠道菌群方面，利福昔明同样被证实能够上调PA-HSOS小鼠菌群的丰度及多样性。Lu等 ［ 12 ］ 研究结果提示，厚壁菌门与拟杆菌门的比值（F/B）下降是肠道菌群失衡的标志，与功能性胃肠病、肝损伤、肝硬化、肥胖、糖尿病等疾病的发展密切相关。我们发现在予以利福昔明干预后，PA-HSOS小鼠表现出较高的F/B比值。我们进一步在属水平上进行了分析，罗氏菌属、毛螺菌科_UCG-006、毛螺菌科NK4A136组、拟杆菌属、颤螺菌属、瘤胃球菌属、另枝菌属的表达量在利福昔明处理后显著升高。其中这些有差异的菌群大部分属于短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFAs）产生菌，包括罗氏菌属、瘤胃球菌属以及颤螺菌属等。这表明SCFAs产生菌在利福昔明的药效发挥中起重要作用。研究表明，SCFAs产生菌能够降解膳食纤维形成乙酸、丁酸和丙酸等物质为肠道上皮细胞提供能量来源，通过上调紧密连接蛋白如黏附蛋白ZO-1和闭合蛋白的表达来维持肠黏膜机械屏障的完整性，尤其以丁酸更为显著 ［ 13 ］ 。Meng等 ［ 14 ］ 的研究结果也提示，利福昔明可以通过调节肠道菌群（主要是瘤胃球菌属）增加肠道屏障完整性，有效预防昼夜规律紊乱诱导的神经炎症和认知障碍。本研究结果还显示，利福昔明除了增加PA-HSOS小鼠模型中SCFAs产生菌外，还降低了条件致病菌Erysipelatoclostridium以及红蝽菌科_UCG-002的相对丰度。这些菌属作为一种潜在病原体参与炎症性疾病的进展，包括炎症性肠病、类风湿关节炎以及强直性脊柱炎等，且与炎性因子TNF-α呈显著正相关 ［ 15 ］ 。以上的这些数据表明，利福昔明对野百合碱诱导的PA-HSOS的影响可能部分归因于肠道菌群的调节。
越来越多的证据表明，肠道微生物及其代谢产物可通过影响肠黏膜上皮细胞更新、肠道通透性、肠道抗菌肽的释放及肠道黏液层等调节肠黏膜屏障功能，在肝脏疾病中扮演着重要角色 ［ 13 ］ 。进一步分析发现，利福昔明干预后的差异菌群与肠道屏障完整性密切关联。我们的研究也证实了这一现象，利福昔明能够增加PA-HSOS小鼠结肠组织中的杯状细胞数量，上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的mRNA表达水平从而增强肠道屏障功能，这与最近的一项研究结果 ［ 16 ］ 相一致。尽管我们在造模周期以及利福昔明的剂量上略有不同，且他们并没有进一步分析利福昔明保护肠道屏障的具体机制 ［ 16 ］ 。而在PA-HSOS小鼠肠道屏障修复后能够防止脂多糖和有害细菌转位进入肝脏从而减轻肝脏损伤，这也进一步提示“肠-肝轴”在该疾病中的重要性。
综上所述，利福昔明能够减轻野百合碱所致HSOS小鼠的肝损伤，其机制可能是通过调节肠道菌群进而改善肠道屏障功能发挥作用，可作为靶向PA-HSOS治疗策略中的又一武器。本研究为初步的实验探索，关于肠道菌群与PA-HSOS之间的因果关系以及临床上利福昔明应用的时机和剂量还有待进一步研究。
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