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题目：通过多组学分析和实验验证鉴定预测膀胱癌免疫治疗反应的肿瘤特异性 T 细胞特征
杂志：Cancer Cell International
影响因子：5.3
发表时间：2024年7月
公众号后台回复“666”领取原文PDF，文献编号：20241010
研究背景
膀胱癌是全球十大最常见的恶性肿瘤之一，目前的治疗以手术为主，放疗和化疗为辅。近年来，免疫治疗晚期膀胱癌的临床疗效和安全性已在多项临床研究中得到证实，而免疫治疗策略并不适用于所有的膀胱癌患者，关键是如何精确地选择可能从免疫治疗中受益的膀胱癌患者。本研究旨在鉴定和构建肿瘤特异性T细胞特征（TstcSig）来预测膀胱癌免疫治疗的结果，以期阐明肿瘤特异性T细胞的转录特征，并精确选择可能受益于免疫治疗的膀胱癌患者。
数据来源
膀胱癌肿瘤特异性T细胞相关基因来自Gene expression omnibus（GEO）数据库中人膀胱肿瘤和非恶性组织T细胞的单细胞RNA和配对T细胞受体（TCR）测序数据（GSE149652）。IMvigor210队列的基因表达和临床数据来自IMvigor210CoreBiologies包。膀胱癌免疫治疗队列（GSE176307）来自GEO数据库。此外，黑色素瘤免疫治疗队列（PRJEB23709）来自EMBL-EBI数据库。膀胱癌组织的单细胞RNA测序（GSE145281）和空间转录组数据（GSE171351）来自GEO数据库。33种癌症类型的大量肿瘤转录组和临床数据来自The cancer Genome Atlas（TCGA）数据库。
研究思路
首先，利用基因表达综合数据库（GEO）的单细胞RNA和TCR测序技术鉴定膀胱癌中肿瘤特异性T细胞相关基因，进一步构建肿瘤特异性T细胞特征（TstcSig），并验证了其在多个免疫治疗队列中预测免疫治疗反应的临床相关性。其次，分析了TCGA和GEO数据库中其他队列膀胱癌患者的TstcSig免疫特征。最后，采用Western blot（WB）、多色免疫荧光（MIF）、qRT-PCR和流式细胞术等方法验证生物信息学分析结果。
主要结果
1. 肿瘤特异性T细胞相关基因的鉴定
通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和TCR测序（TCR-seq）探索了T细胞在肿瘤及其邻近组织中的转录特征，鉴定出膀胱癌中肿瘤特异性T细胞；通过差异表达基因（DEG）分析鉴定了39个枢纽基因；通过基因本体论（GO）分析表明，这39个枢纽基因主要与T细胞激活途径相关；通过京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析显示，这39个枢纽基因丰富了癌症中的PD-L1表达和PD1检查点通路（图1）。通过在IMvigor210队列中进行单变量Cox回归分析，发现8个肿瘤特异性T细胞相关基因与膀胱癌患者的总生存率（OS）显著相关；通过Kaplan-Meier生存分析显示，在接受免疫治疗的膀胱癌患者中，其中6个基因的高表达与更好的预后相关；通过相关性分析，发现VAMP5、TIGIT、LCK、CD27、CACYBP与T细胞浸润有显著相关性。
图1 利用单细胞RNA测序分析鉴定肿瘤特异性T细胞相关基因
2. 肿瘤特异性T细胞特征与抗肿瘤免疫和免疫治疗应答相关
基于与生存和T细胞浸润相关的5个肿瘤特异性T细胞相关基因（VAMP5、TIGIT、LCK、CD27、CACYBP）构建了TstcSig；通过免疫浸润分析、ESTIMATE分析、基因集富集分析（GSEA），结果表明，TstcSig与免疫细胞浸润水平呈正相关，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，与免疫治疗的疗效相关（图2）。
图2 肿瘤特异性T细胞特征与抗肿瘤免疫相关
3. TstcSig预测免疫治疗反应及其潜在的生物学作用
通过在IMvigor210队列中研究TstcSig与免疫治疗疗效之间的关系，结果表明，TstcSig不仅可以反映肿瘤的免疫原性，还可以预测膀胱癌的免疫治疗反应；进一步分析另外两个免疫治疗队列（包括膀胱癌队列和黑色素瘤队列），结果加强了TstcSig与免疫治疗反应之间的联系（图3）。比较TstcSig与其他109个T细胞特征，通过对三个免疫治疗队列的总生存率进行单变量Cox回归分析、Kaplan-Meier分析显示，TstcSig在所有队列中都显示出出色的预测价值。
图3 验证TstcSig在多个免疫治疗队列中的免疫治疗预后价值
4. 利用单细胞和空间转录组学证实TstcSig与T细胞浸润之间的相关性
通过单细胞RNA测序和空间转录组数据，验证了TstcSig与T细胞浸润之间的相关性。单细胞数据分析显示，应答患者的T细胞TstcSig评分显著高于无应答者；空间转录组数据分析显示，TstcSig与抗肿瘤新抗原相关的T细胞特征(NeoTCR4和NeoTCR8)显著相关，表明TstcSig可能与新抗原特异性T细胞浸润有关（图4）。
图4 空间转录组学分析揭示膀胱癌T细胞TstcSig评分
5. TstcSig的泛癌预后分析
通过分析33种肿瘤类型的RNA-seq数据，结果显示TstcSig水平具有显著的异质性，结果强调了在大多数癌症类型中TstcSig与T细胞浸润之间的正相关，并证明了TstcSig在不同癌症类型中的预后价值存在异质性（图5）。
图5 TstcSig异质性及其在人类癌症中的预后价值
6. 肿瘤特异性T细胞hub基因表达和抗肿瘤特性的验证
通过Western blot、免疫荧光分析、qRT-PCR、流式细胞术验证生物信息学分析结果，结果表明，肿瘤特异性T细胞高度表达CD27，并分泌更高水平的IFN-γ和GZMB，增强了它们杀死肿瘤细胞的能力（图6）。
图6 流式细胞术分析肿瘤特异性T细胞的特征
文章小结
该研究利用单细胞多组学数据开发并验证了一个新的肿瘤特异性T细胞特征（包括VAMP5, TIGIT, LCK, CD27和CACYBP）作为膀胱癌免疫治疗患者的预后生物标志物。这样一篇干湿思路，一举拿下中科院二区5分+SCI！可太适合生信小白来模仿复现啦！如有问题，欢迎进交流群沟通（添加小编可入群）~更多创新思路，欢迎滴滴！
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