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第一，scRNA-seq分析。该研究利用来自公共数据库的scRNA-seq数据来深入分析PCa中的M2型巨噬细胞，基于该技术的分析可以研究单个细胞内的基因表达，使分析肿瘤微环境（TME）的不同组分及其相互作用成为可能，为理解TME提供了新视角。
第二，M2型巨噬细胞。该研究基于M2型巨噬细胞的标记物开发了一个预后模型，并使用多个独立数据集对该模型进行了验证，这种基于生物标志物的风险评分模型为PCa的个性化治疗提供了可能。
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题目：综合scRNA-seq 分析以鉴定预测前列腺癌预后的M2型巨噬细胞的新标志物
杂志：Annals of Medicine
影响因子：4.9
发表时间：2024年9月
公众号后台回复“666”领取原文PDF，文献编号：20241014
研究背景
前列腺癌（PCa）已成为世界上发病率最高的男性恶性肿瘤。肿瘤微环境是肿瘤生长所必需的。M2巨噬细胞在许多实体瘤中起重要作用。本研究旨在利用单细胞测序技术探讨M2巨噬细胞在PCa中的预后价值。
数据来源
PRAD患者的bulk RNA-seq数据(TCGA-PRAD队列)和相应的临床资料来自TCGA数据库；GSE54691、GSE116918、GSE137829、GSE137829数据集的基因图谱、临床数据、细胞转录组数据来自GEO数据库。
研究思路
单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据和mRNA表达数据来自GEO数据库和TCGA数据库。使用Seruat软件包对scRNA-seq数据进行质量控制、归一化、约简、聚类和细胞注释。分析肿瘤相关巨噬细胞亚群，筛选M2巨噬细胞的标记基因。用limma法鉴定PCa中的差异表达基因（DEGs），用CIBERSORTx法检测免疫浸润。然后，构建加权相关网络分析（WGCNA）来鉴定M2巨噬细胞相关模块和基因。整合scRNA-seq数据分析中M2巨噬细胞的标记基因和WGCNA数据中的枢纽基因，基于单变量和LASSO回归分析选择预后基因特征。计算风险评分，并探讨与风险评分相关的DEG、生物学功能、免疫特性，并构造了预测列线图。用CCK8、Transwell和伤口愈合来验证共培养后细胞表型的变化。
主要结果
1. 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的亚群分析
通过GEO和TCGA数据库获取PCa的scRNA-seq数据和mRNA表达数据，使用Seurat包对scRNA-seq数据进行质量控制、标准化、降维、聚类和细胞注释，得到了7种细胞类型：基础/中间细胞、内皮细胞、成纤维细胞、Luminal细胞、肥大细胞、单核细胞、T细胞。通过单核细胞亚群分析、TAM亚群分析，提取了M1型和M2型TAM的标记基因（2431个基因），并通过GO和Reactome分析进行相关通路分析。
2. 预后模型的构建与验证
通过对癌组织与良性组织进行差异表达基因（DEG）分析，筛选了524个DEGs；通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选与M2 TAM相关的基因模块和关键基因，提取了650个hub基因。将从scRNA-seq数据分析中获得的2431个M2巨噬细胞标记物与从bulk RNA-seq数据分析中获得的650个M2 hub基因相交，共获得113个交叉基因；通过单变量COX回归分析、LASSO回归分析获得了与预后相关的9个基因（SMOC2、PLPP1、HES1、STMN1、GPR160、ABCG1、MAZ、MYC、EPCAM ）。根据基因表达水平及其回归系数计算M2风险评分，将训练集TCGA-PRAD和外部验证集中的所有患者分为M2高、低风险组，通过Kaplan-Meier （KM）曲线、受试者工作特征（ROC）曲线的曲线下面积（AUC）值来估计风险模型的预测能力，结果显示，该模型具有较好的预后价值（图1）。通过单因素、多因素分析显示，M2风险评分是PCa预后的独立预测因子。
图1 M2风险评分模型对训练集TCGA-PRAD的预后价值
使用年龄、T分期和M2风险评分构建预测PRAD患者总生存率（OS）的列线图，通过校正曲线显示，预测OS与实际生存时间一致性较好，通过决策曲线分析（DCA）显示，该模型在预测OS方面具有较好的有效性和实用性。
图2 PRAD M2风险评分预测OS的列线图
3. M2高、低风险组的免疫浸润分析、免疫检查点、免疫治疗和化疗反应
基于单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法确定每个样本的免疫评分、ESTIMATE评分、Strome评分、肿瘤纯度，采用Kruskal-Wallis检验显示，M2高、低风险组在ESTIMATE评分、免疫评分、基质评分、肿瘤纯度方面差异显著；通过免疫浸润分析显示，初代B细胞、M2巨噬细胞、CD4 + 记忆T细胞间存在显著差异（图3）。
图3 免疫细胞浸润分析
通过计算和分析发现，M2高、低风险组之间有34个免疫检查点存在显著差异；M2评分高的患者的表达模式与CTLA4-nOR抑制剂应答的患者更相似，M2评分低组与PD1-R抑制剂反应组表达模式更接近；M2高、低风险组化疗药物差异：长春花碱、阿糖胞苷、吉非替尼等（图4）。
图4 免疫检查点，免疫治疗和化疗反应分析
4. M2-TAM对PCa的促进作用
通过CCK8、伤口愈合和Transwell侵袭实验，结果表明，所有M2共培养的PCa细胞株的增殖和侵袭能力均高于正常培养的细胞株；DU145和PC3细胞株共培养后迁移能力增强（图5）。
图5 M2-TAM可促进PCa细胞的增殖、迁移和侵袭
文章小结
该研究发现M2型巨噬细胞和相关基因在促进前列腺癌的发生、发展和转移中发挥了关键作用，并在前列腺癌中发挥了令人信服的预测作用，构建的风险评分模型和列线图对PCa的生存和预后有较好的预测能力。该文选择了巨噬细胞这个大热点，结合国自然热点能让你的课题锦上添花！再加上单细胞测序数据和实验验证，发至中科院二区SCI 名至实归！想复现的朋友，可以联系胡哥定制分析~专业的团队和服务，更多创新思路等着您！
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