在非小细胞肺癌（NSCLC）领域，HER2蛋白表达、基因扩增与突变之间的异质性关联，以及检测这些变异的最佳方法，目前尚未明确。一项研究[1]旨在阐明HER2变异NSCLC的临床病理和分子特征，并探索实际可行的方法，以识别可能从抗HER2靶向治疗中获益的患者群体。结果表明，HER2变异NSCLC患者中，HER2酪氨酸激酶域（TKD）突变与特定临床病理学特征相关，并且预示着较差的预后。研究还发现，即使在HER2基因扩增患者中，也存在HER2蛋白表达水平较低的情况，这表明HER2基因的拷贝数和蛋白表达水平之间可能存在不一致性。而这种不一致性可能与其他驱动基因的变异有关。因此，建议使用NGS检测HER2变异，并结合临床病理学特征来筛选适合抗HER2靶向治疗的患者，从而为这一患者群体的治疗提供新方向。现将该研究主要内容梳理如下，以飨读者。
案例选择
在2018年至2023年6月期间，采用NGS针对本机构NSCLC患者进行HER2变异的筛查。在1680例接受NGS检测的NSCLC患者中，发现105名患者存在HER2基因扩增（拷贝数[CN]≥4）或致癌性突变。在这些患者中，43名（占2.5%）表现出HER2基因扩增（CN≥4），另外62名（占3.6%）则存在HER2基因突变。由于免疫组化（IHC）样本不足，6名患者未能纳入研究。剩余的99名患者中，HER2变异的确认是基于53名患者的活检样本和46名患者的手术样本。在这些患者中，有49名在进行活检或手术前未接受任何治疗，而另外46名患者则接受了新辅助或明确的化疗，其中包括6名接受表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）治疗的HER2扩增患者。这6名患者因被认定其HER2基因扩增导致对TKI治疗产生耐药性，故未被纳入分析范围之内。
本研究对照组由2021年1月收集的165名经NGS检测确认无HER2基因突变的患者组成。其中，97名为接受手术切除腺癌的患者，另外68名则为之前接受过HER2免疫组化检测的患者。
HER2基因状态，包括其扩增与突变情况，通过两种NGS panel进行检测：TruSight™ Oncology 500（由美国加利福尼亚州圣地亚哥的Illumina公司生产）和CancerSCAN（由韩国首尔的Geninus公司开发）。
临床病理学评估
本研究中，临床及影像学数据均源自患者病历。临床信息的收集涵盖了患者的年龄、吸烟史、临床或病理分期、计算机断层扫描（CT）结果、随访时间以及治疗历程。两位经过认证的病理学家对组织切片进行详尽审查，并依据2021年世界卫生组织肺肿瘤分类标准，对组织学分级及亚型进行评估。在腺癌的腺泡型和乳头型分类中，若高分化组织学特征（如筛状、复杂腺体、实性和微乳头状）所占比例低于20%，则被判定为中度分化；若该比例达到或超过20%，则被判定为低分化。为探究HER2 TKD突变与不同临床病理特征之间的关系，本研究特别评估了微乳头状组织学特征，其表现为肿瘤细胞以乳头状丛形式排列，形成缺乏纤维血管核心的花束状结构，且该特征的增量为5%。肺转移的定义为双肺中存在三个或更多结节的影像学证据。小结节性肺部病变表现为双侧肺部广泛分布的微小结节（miliary lungs），以及淋巴血管转移，均通过CT进行影像学评估，并对每种病变类型进行单独计数。所有患者的临床和病理分期均依据第8版美国癌症联合委员会（AJCC）系统进行评估。
所有患者都进行了免疫组化（IHC）检测，其中30名患者进一步进行了银染原位杂交（SISH）检测，以评估HER2的表达水平和HER2扩增状态。HER2 IHC和SISH检测均需遵循ASCO/CAP指南。
在异质性HER2变异和对照组中比较临床病理和分子特征
在对1680名患者进行研究时，通过NGS技术检测出30名（占1.8%）患者存在HER2基因扩增，而通过SISH技术则识别出59名（占3.5%）患者具有HER2基因突变。在比较两组数据时，若拷贝数（CN）存在差异，则以SISH结果为准。在NGS检测中，有4名患者的CN值超过4，而经SISH确认为CEP17多体，故将这些病例排除在统计分析之外。
图1. HER2变异NSCLC的临床病理学和分子特征
本研究表明，NSCLC中HER2基因扩增和突变的比例介于2%至4%之间。在这些HER2突变患者中，有48例（占81.4%）存在外显子20插入突变，而11例（占18.6%）则表现为点突变。根据突变的位置，HER2突变被进一步细分为52个TKD突变和7个非TKD突变。在两个外显子20插入突变和三个点突变病例中，这些突变与基因扩增同时出现。而同时发生改变的病例在统计学分析中被归类为突变。
此外，超过96.6%的患者被诊断为TNM分期III期或更高分期。试验组与对照组在疾病分期上无显著差异。在67.4%的患者中，HER2变异与TP53突变同时存在，其中包含80%的扩增病例，59.6%的HER2 TKD突变病例，以及71.4%的非TKD突变病例。尽管非TKD突变与扩增同TP53突变共存的频率高于HER2 TKD突变，但此差异并不显著（P=0.102）。然而，相较于对照组，这种共存频率显著更高（P=0.006）。HER2 TKD突变，包括HER2外显子20插入，在不吸烟者（75%）和年轻女性患者（78.8%）中更为常见，平均年龄为58.6岁，与非TKD突变（P<0.001和0.032）以及对照组（P<0.001和0.002）相比，差异显著。HER2 TKD突变与非TKD变异展现出不同的分子和病理特征。尽管携带非TKD突变或扩增的患者通常伴有其他驱动突变，如EGFR、KRAS和SMARCA4，但TKD突变与其他驱动突变呈互斥关系（P<0.001）。携带HER2 TKD突变的患者仅表现出腺癌组织学类型，而携带非TKD突变或扩增的患者则表现出鳞状细胞癌（P=0.011）（图2A-B）。
图2. HER2变异的组织学和免疫组化（IHC）模式
在HER2基因扩增患者中，通常可以观察到肿瘤的实体生长伴随着中心性坏死以及高级别的细胞异型性（图2C-D）。在HER2基因突变的腺癌病例中，肿瘤细胞往往展现出丰富的细胞质、较大的细胞核以及显著的细胞间连接（图2E-F）。此外，局部微乳头状结构的存在也经常被识别出来（图2G-H和I-J）。HER2 TKD突变病例显示出相比对照组更高的微乳头状模式发生率（P<0.001）。肺部转移的发生率，包括细小的肺转移和血淋巴管转移，在HER2 TKD突变病例中显著高于对照组（P<0.001）。
与TKD突变相比，非TKD HER2突变表现出不同的特性。男性患者更多见（85.7%），1例患者表现为非腺癌的鳞状细胞癌。同时伴有EGFR和KRAS突变的两个HER2点突变被鉴定为非TKD突变：D277H，胞外结构域突变；G660D，跨膜结构域突变。在11个HER2点突变中，4个位于TKD (包括L755P和V777L)，另外7个位于TKD区域外。
HER2变异组的中位总生存期（OS）为30.3个月，对照组为25.9个月。HER2 TKD突变和总HER2变异，包括HER2扩增和非TKD突变，与对照组相比OS更差（图3A-B）。在HER2变异组内，非TKD突变组的OS低于TKD突变组；然而，该差异不显著（图3C）。
在进行SISH检测的30名患者中，HER2 SISH分析揭示了7名（占23.3%）患者存在多体性现象，具体表现为染色体17的中心粒（CEP17）数量增加。在这些患者中，4名患者的HER2基因扩增结果为阴性，而另外3名患者的HER2基因拷贝数增加超过6。在30名HER2基因扩增患者中，21名（占70%）表现出3+的膜免疫活性（图2B），而7名（占23.3%）患者则呈现出1+至2+的膜表达模式（图2D）。即便在没有HER2基因扩增的情况下，在52名携带TKD突变的患者中，有33名（占63.5%），包括外显子20插入突变的患者，也表现出1+至2+的免疫活性评分，并呈现出完全或不完全的膜表达模式（图2H和J）。在7名携带非TKD点突变的患者中，4名（占57.2%）表现出不同程度的膜染色（图2F），而与HER2基因扩增共存的一名非TKD点突变患者则显示出3+的膜IHC评分。尽管HER2变异组中IHC评分为1+和2+的患者比例显著较高，但在68名对照患者中，也有20名（占29.9%）患者显示出1+或2+的免疫活性（图2K和L）。HER2变异组与对照组的HER2 IHC分析结果在图4A和B中有详细总结。
在部分患者中，尽管HER2基因拷贝数显著增高（超过7），其免疫活性却表现不佳，呈现出一种不一致的状态。在26名经SISH检测确认为HER2基因扩增的患者中，有6名（占23.1%）同时存在HER2外显子20插入或其他驱动基因变异，例如EGFR、KRAS和SMARCA4（P≤0.001）（表1A）。一位处于不一致状态的患者，尽管其HER2基因拷贝数极度扩增（达到42.4），但其IHC评分为2+（占40%）（图5A和B）。通过NGS检测发现，该患者同时存在KRAS G13D突变，且之前未接受过任何治疗。综合来看，在7名携带HER2点突变的患者中，有4名（占57%）以及在30名HER2基因扩增的患者中，有10名（占33.3%）存在其他共存的驱动突变，这可能是导致HER2 IHC染色不一致和HER2基因扩增异质性模式的原因。在26名经SISH检测确认为HER2基因扩增的患者中，有4名（占15.4%）在IHC和SISH信号中表现出异质性模式（表1B）。其中一位患者（占3.8%）显示出空间上不同的异质性（图5C）。微乳头状模式（图5D）显示出IHC 3+评分（占60%）和更高的拷贝数（图5F），而腺泡模式（图5E）显示出IHC 2+评分（占40%）和轻度扩增（图5G）。该患者伴随有SMARCA4突变，弥漫性BRG1 IHC缺失和HER2基因扩增（拷贝数9.1）。在扩增患者中，有两名（占比6.7%）表现出混合模式，其细胞团IHC评分为2+，并且有30%的细胞呈现染色（图5H）。这些细胞团中同时存在HER2基因扩增和未扩增的细胞（图5I）。在两名携带HER2外显子20插入（p.Y772_A775dup）的患者中观察到扩增的混合模式，拷贝数超过7。一位患者显示出马赛克类型，有异常IHC 2+（图5J）和扩增细胞散布在非扩增细胞之间（图5K）。马赛克型扩增模式伴随着SMARCA4突变和BRG1 IHC缺失。
胃癌与乳腺癌HER2评分系统的比较结果，包括扩增与突变方面的分析，已汇总于表2。该评分系统对HER2突变和扩增的1+及2+结果的解读产生了影响。依据胃癌的评分体系，若存在10%或更多的弱至中等强度的基底侧膜染色，则被归类为2+。相对地，根据乳腺癌HER2评分体系，若未超过10%的完整膜染色，则被归类为1+（图2H）。在将2+和3+视为扩增导致过表达的指标时，乳腺癌评分体系展现了更高的特异性（91%）和准确性（90%），尽管此差异在统计学上并不显著。若仅将3+视为过表达的指标，其敏感性虽低于将2+和3+均考虑在内的情况（70%），但达到了最高的准确性（91%）和特异性（100%）。综合考虑突变的1+/2+或所有HER2变异的1+/2+/3+，胃癌与乳腺癌HER2评分方法在敏感性、特异性和准确性方面均表现出一致性。
在43名HER2基因扩增及点突变患者中，有6名（约14%）患者同时存在EGFR基因突变，并接受了EGFR-TKI治疗。因此，这些患者未被纳入HER2相关分析。这6名患者的HER2基因平均拷贝数（CN）为22.9。其中3名患者呈现EGFR外显子21 L858R突变，HER2 IHC评分为3+，而其余患者则表现为EGFR外显子19缺失，其中一例患者的HER2 IHC评分为0，另外两例为1+或2+。后3名携带EGFR外显子19缺失的患者尽管拷贝数较高（>7），但HER2 IHC表达较低，显示出不一致的表达状态。在2名患者中观察到HER2 IHC结果的异质性，通过SISH分析确认为马赛克型扩增。在这2个案例中，胃癌和乳腺癌评分系统对IHC结果的解释存在分歧，分别导致了2+和1+的判读差异。
本研究表明，携带HER2 TKD突变的HER2变异NSCLC患者与对照组相比，OS更短，这突显了识别可能从抗HER2靶向治疗中获益的患者的重要性。研究还发现，HER2 TKD突变和HER2扩增伴随IHC 3+过表达是主要的驱动突变，而HER2非TKD突变和HER2扩增伴随较低IHC表达通常是在针对其他驱动变异的治疗中出现的耐药机制。研究强调了HER2变异NSCLC中与HER2 IHC和SISH异质性显著相关的分子共变异，并提出NGS可能是检测NSCLC中HER2变异的最优方法，包括识别同时发生的变异。此外，研究还指出，年轻患者、非吸烟者、女性、血淋巴管性粟粒状肺转移患者、腺癌患者以及HER2 IHC结果可以作为识别HER2变异NSCLC患者的有价值指标。这些发现对于肺癌领域未来研究方向具有重要意义，特别是在为这一复杂多样的NSCLC子集开发更有效治疗方法的过程中。研究结果还表明，有必要进行更深入的探究，以明确哪些患者群体适合接受抗HER2靶向治疗，特别是那些在IHC和SISH检测中表现出HER2扩增模式异质性的病例。这提示了在治疗HER2变异NSCLC时，需要更为精确的生物标志物以及更为个性化的治疗方案。
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