《温病条辨》是清代温病学说标志性著作，在中医温病学的发展过程中极具代表性，吴鞠通在本著作中归纳和阐述温病的治法和方药时，强调了扶助正气可以更有效地防治温病。人参，甘，微苦，微温，归脾、肺、心、肾经。有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智之功效[1]。《温病条辨》中，使用甘温之人参则十分广泛，其用参之道，尊古而不泥古，临证用药独到。本文基于数据挖掘，以人参为中心，运用数据挖掘和网络药理学方法，探析核心药物组合的有效成分、作用靶点及信号通路，探究吴鞠通《温病条辨》运用人参治疗温病的用药规律，传承中医理论，促进中医药科研发展和中医药现代化。
1.1数据来源
以人民卫生出版社出版的杨进主编的第一版《温病条辨》为基础数据源[2]。
1.2数据筛选
以“人参”为主题词，通过检索和人工筛选，整理选取《温病条辨》中含有人参的方剂并记录，剔除重复方剂。
《温病条辨》虽为温病专著，但其中也含有治疗寒湿的方剂。上焦篇的补秋燥胜气论，多属寒燥；中焦篇为了和湿热比较分析，体现了寒湿；下焦篇的湿温有湿热，也有寒湿。寒湿本不属于温病范畴，因此还需将治疗寒湿的含有人参的方剂剔除。
1.3数据规范
参考《中药大辞典（第2版）》[3]、《中国中医药学主题词表》[4]、2020年版《中华人民共和国药典》[1]，对中药名称及性味归经等进行规范。药名方面，如“干地黄”规范为“生地黄”，“麦门冬”规范为“麦冬”；由于不同炮制方法会对药效产生影响，故保留“炙甘草”、“炒白芍”等名称，“生地黄”、“熟地黄”等分别统计[5]。
1.4数据录入与分析
将规范后的方剂录入Ex‐cel表格，再将Excel数据录入到TCMICS V3.5软件进行分析处理。为避免录入过程中可能出现的失误，由2名研究人员分别对数据进行审核和校准，以保证数据的准确性。
采用TCMICS V3.5“软件数据分析”中的“方剂分析”模块进行信息捕捉，对复方中的药物频次、四气、五味、归经、功效数据进行运算，并制成可视化的雷达图。结合聚类分析和关联规则分析，挖掘处方规律、关系图谱及核心药物组合。
1.5核心药物组合有效成分及靶点
以TCMSP[6]V2.3作为成分检索数据库，以聚类分析所得核心药物组合中的中药分别为关键词，检索获取有效成分，并进行整合与去重。将口服生物利用度（OB）≥30%与类药性（DL）≥0.18[7]作为筛选条件，将筛选好的成分复制到Excel表中，在Pubchem数据库检测分子质量（Mw）是否和表中一致。对于TCMSP中检索不到的中药，则选择HERB数据库，按Lipinsk五原则（亲脂性≤5，氢键供体数量≤5，羟基数量≤10，分子量≤500，可旋转键数量≤10）进行筛选[8-9]。借助Swiss Target Prediction数据库，将靶点转换为基因名称。
1.6核心药物-活性成分-靶点网络构建
采用Cytoscape 3.9.1软件进行可视化处理，构建核心药物-活性成分-靶点之间的网络图，筛选出重要靶点和化合物。
1.7基因富集分析
将药物靶点蛋白输入DAVID 2021数据库[10]，将物种限定为“HOMO sa‐piens”，进行基因本体（Gene Ontology,GO）的富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Ency‐clopedia of Genes and Genomes,KEGG）的信号通路富集分析，筛选出差异显著的生物过程（Bio‐logical process,BP）、细胞组分（Cellular compo‐nent,CC）、分子功能（Molecular function,MF）及KEGG通路，并通过微生信网站对结果进行可视化呈现，探究核心药物组合的药理作用及其主要的信号通路。
2.1中药的性味归经
《温病条辨》全书治疗温病的人参方剂有43首。43首人参方剂中，用药药性以温为主，其次为寒、平，药味以甘、苦、辛为主，归经主要归脾、肺、心、肾经。见表1。
表1 43首人参方剂的中药性味归经统计
2.2中药功效
对43首人参方剂的中药功效进行统计，其中频次最高的为补虚类，其次分别为收涩类、消热类。见表2。
表2 43首人参方剂的中药功效统计
2.3组合频次及关联规则
通过对复方中的中药关联规则进行计算，可得出不同中药之间的组合关系。设置置信度≥0.6、支持度≥5为初始参数，分析用药规则，显示出13味与人参组合的核心药物，关联规则见图1。置信度是方剂中A药出现时，B药出现的概率。置信度越高，说明用药配伍关联性越强。支持度=支持度个数/总处方数量。支持度越高，说明方剂用药越集中[6]。因此，为了筛选出用药更集中的方剂，设置置信度≥0.6、支持度≥8，初步得出4味与人参组合的核心药物，频次由高到低分别为麦冬、炙甘草、当归、阿胶。统计情况及关联规则见表3、图2。
图1 13味与人参组合的核心药物关系图（置信度≥0.6，支持度≥5)
表3 4味与人参组合的核心药物关联规则及频次统计（置信度≥0.6，支持度≥8)
图2 4味与人参组合的核心药物关系图（置信度≥0.6，支持度≥8)
2.4层级聚类分析
以43个含人参方剂的分析为依据，分别设置k=3、k=4展开聚类分析。根据统计结果，结合临床判断，以k=3的结果确定3类核心组合：(1)人参、黄连、干姜、黄芩、枳实；(2)人参、麦冬、生甘草、白粳米、炙甘草；(3)人参、麦冬、当归、炙甘草、阿胶。43首含人参的方剂中，与核心组合(3)类似的处方最多，共计24首。为更好地展现聚类效果，基于该方法和平均聚类分析，将kmeans算法和回归模型相结合，实现了对聚类结果的描述。将43首含人参的方剂进行聚类，图示中不同的颜色代表不同类别，不同颜色点数的多少代表方剂的数量多少。越是接近于这条回归曲线，表示与此类别的核心药物（类方的基本组成）越接近，反之，表示与此类别的核心药物（类方的基本组成）越远。方剂聚类分析图见图3。
图3 43首含人参方剂聚类分析图
注：红色圆点代表核心组合：人参、黄连、干姜、黄芩、枳实；浅绿色圆点代表核心组合：人参、麦冬、生甘草、白粳米、炙甘草；深绿色圆点代表核心组合：人参、麦冬、当归、炙甘草、阿胶
对结合药物组合频次的结果进行筛选，发现聚类分析的第(3)组合（麦冬、炙甘草、当归、阿胶与人参组合）的频次较高，置信度均>0.8，并且具有一定的关联规则。因此，最终确定核心药物组合为人参-麦冬-炙甘草-当归-阿胶。
2.5核心药物组合主要活性成分
由于数据库没有炙甘草，因此由甘草替代炙甘草在数据库中进行检索。在TCMSP数据库中获得人参、甘草、当归的活性成分共116个，对应7 504个靶点。在HERB数据库中得到麦冬、阿胶的活性成分共22个，对应1 254个靶点。将得到的预测靶点导入Swiss Target Prediction数据库中转换为相应的基因靶点名称，去重后共得到对应靶点名称949个。
2.6核心药物-活性成分-靶点网络图构建
核心药物-活性成分-靶点网络图中共有1 084个节点和8 863条边，见图4。其中蓝色六边形为药物活性成分；橘色三角形代表核心组合中的草药，从左到右依次代表阿胶、当归、麦冬、甘草、人参；粉色长方形代表基因。根据Cytoscape软件中的“Ana‐lyze Network”工具得到节点的属性特征。在网络中节点越大，代表其度值越高，与其他节点有更高的关联度。其中雌激素受体1(ESR1）、雌激素受体2(ESR2）、雌激素合成酶（CYP19A1）、蛋白酪氨酸磷酸酶N1(PTPN1）的度值均超过70，表示其在网络中与靶标有着较高关联度。核心药物中有23种成分与以上基因关联度较高（度值≥80），见表4。除此之外，17β-羟甾类固醇脱氢酶2(HSD17B2）、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、钙调蛋白（HSP90AA1）、17β-羟甾类固醇脱氢酶1(HSD17B1）、表皮生长因子受体（EGFR）、腺苷A1受体（ADORA1）等亦是较为重要的靶标。
2.7 GO富集分析
运用DAVID数据库将核心药物组合中5味药的靶点进行GO富集分析，结果用微生信在线作图展示，将MF、BP、CC 3个部分组合呈现。得到GO条目共7 238个，其中MF条目939个，主要涉及蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性（Protein serine/threonine kinase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（Protein tyrosine kinase activity）、核受体活性（Nuclear receptor activity）、配体激活的转录因子活性（Ligand-activated transcription fac‐tor activity）等；BP条目5 753个，主要涉及配体激活的转录因子活动（Protein autophosphorylation）、肽基丝氨酸磷酸化（Peptidyl-serine phosphoryla‐tion）、肽基丝氨酸改性（Peptidyl-serine modifica‐tion）、肽基酪氨酸修饰（Peptidyl-tyrosine modifica‐tion）等方面；CC条目546个，主要涉及膜筏（Mem‐brane raft）、膜微区（Membrane microdomain）、膜区（Membrane region）、突触后膜（Postsynaptic mem‐brane）等。输出各组分排名前10的条目，绘制成柱状图，见图5,X轴代表目标基因中属于该GO条目的富集分值，Y轴代表GO条目。
表4 人参核心药物组合中的药物活性成分的网络节点信息
2.8 KEGG富集分析
通过DAVID数据库将核心药物组合中5味药的靶点进行KEGG通路富集分析，结果得到信号通路共199条（P<0.05），主要涉及神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、钙信号（Calcium sig‐naling pathway）、c AMP信号通路（c AMP signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling path‐way）等。将输出富集结果的前10条KEGG信号通路绘制成气泡图，见图6，其中Y轴代表通路名称，X轴代表属于该通路基因的富集分值，气泡大小代表属于该通路的基因数量，颜色代表富集显著性。
“温病”即“热病”，“温病”最早见于《素问·生气通天论》：“冬伤于寒，春必温病”，即冬季感寒集聚体内，春季发为温病。《温病条辨》云“温病耳聋，病系少阴……宜复脉辈复其精”。吴氏认为温病患者行滋阴之法，唯在着力顾及阴精，不必如伤寒之阴阳两虚，需阴阳兼顾，故有“伤寒复脉，兼以通阳，温病复脉，唯宜滋阴”的说法[11]，因此治疗温病需要兼顾阴阳，注重及时补充阴阳之虚，才可祛除温邪，顾护阴液。根据数据挖掘分析显示，《温病条辨》中运用人参方药治疗温病的配伍中，补虚类药物占主要部分，补虚药防温热之邪入里伤阴，扶助正气、补气健脾，使邪不得逆传心包[12]。药物四气属性分布主要为温，其次为寒，温邪为热邪，热者寒之，但苦寒之品恐损及脾阳，佐以温药。药物五味属性以甘、苦、辛居多，有驱寒、润燥、生津、清热及收涩之功[13]。药物归经以脾经为主，肺经、心经、肾经次之，温邪易通过人的口鼻而侵入机体，鼻气通于肺，口气通于胃，肺居高位，邪气首犯肺卫，引起燥热伤肺胃兼气阴两虚，热病久痢伤肺脾之阴，燥热久伤肝肾之阴累及肺阴虚。由此，使用人参配伍的方剂可起到健脾养阴、滋阴生津、益气固脱、补益肺气等功效[14]。
通过聚类分析结合药物组合频次，确定核心药物组合为人参-麦冬-炙甘草-当归-阿胶。“伤阴”是温病发展的疾病关键，阴精的盛衰是温病传变预后的关键问题，临证上强调“救阴”[15]。人参具有扶正祛邪的功效，能有效缓解温病自汗、盗汗后出现的耗气伤津情况，纵观《温病条辨》诸方，多用人参类药进行风证、饮证、痛证、虚证等的治疗，以此起到平衡阴阳、疗损理虚的效用[14]。麦冬可清养肺胃阴津、滋心阴以扩血脉，人参-麦冬配伍是使用频率最高的益气养阴药对组合，炙甘草，甘缓补中、调和诸药。有研究显示，人参含有三萜皂苷类及多糖类化合物，其中皂苷类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用[16]。甘草的主要成分是三萜皂苷和黄酮类，具有抗癌、抗溃疡、抗炎等多种药理作用[17]，因此人参-甘草药对可发挥多种功效。当归，补血养血，活血止痛，人参-当归配伍补益气血，可见于独活寄生汤、当归拈痛汤等经典方剂中。阿胶补血滋阴、润燥、止血，现代药理学研究表明，阿胶具有抗肺损伤、增强免疫、抗炎、抗肿瘤、抗休克等作用，常与人参-麦冬配伍共奏养阴润燥之功。此组合人参、炙甘草补气健脾，培补中土，配伍阿胶、麦冬补血滋阴润燥[18]，配伍当归行气通络，补气生血[19]。
图4 核心药物-活性成分-靶点网络图
注：蓝色六边形为药物活性成分；橘色三角形代表核心组合中的草药，从左到右依次代表阿胶（EJ）、当归（DG）、麦冬（MD）、甘草（GC）、人参（RS）；粉色长方形代表基因
图5 GO富集分析图
图6 KEGG富集分析图
人参-麦冬-炙甘草-当归-阿胶的核心药物组合最能体现出吴鞠通加减复脉汤的核心思想。因疾病数据库中未纳入温病，所以以病因病机相似的肺系疾病作为参考[11]。《千金翼方》载复脉汤（即炙甘草汤）“主虚劳不足，汗出而闷，脉结，心悸”[20]。《外台秘要》运用炙甘草汤治疗虚劳肺痿，“肺痿涎唾多，心中温温液液者”[21]。人参、麦冬、阿胶药组具有养阴润燥，补肺金不足，止咳喘功效。人参、麦冬、阿胶与其他药组合，用于治疗肺脏复虚、胸中短气、咳嗽声微、四肢少力、肺痿损败、气喘、咳嗽有血[22]。《医门法律》提到清燥救肺汤中人参、麦冬、阿胶配伍具有补肺养阴润燥止咳功效[23]。
在药物-活性成分-靶点网络图中，山柰酚、人参皂苷-Rh4＿qt、人参皂苷-Rg5＿qt、槲皮素、甲基麦冬黄烷酮B、β-谷甾醇、豆甾醇等成分与靶点蛋白有较高的结合作用，可能是新处方发挥药效的主要活性成分。而山柰酚为人参和甘草的化学成分，其与靶点结合的度值是其他化合物的2倍。有研究表明，山柰酚可提高大鼠肺功能、逆转肺指数、改善肺组织炎症浸润和纤维化水平，说明山柰酚对肺功能具有保护作用[24]。山柰酚、槲皮素、甲基麦冬黄烷酮B均为黄酮类化合物，黄酮类化合物是主要来源于植物的一类多酚化合物，有较强的抗病毒作用，且副作用小，生物活性高。有研究表明，黄酮类天然化合物对病毒生命周期的各个阶段表现出不同程度的抑制作用[25]。人参皂苷-Rg5＿qt属于人参二醇型热裂解皂苷，药理作用主要包括抗炎、抗过敏、抗癌、促进细胞生长等[26-28]。Ahn等[29]研究认为，人参皂苷-Rg5＿qt的预处理减弱了NF-κB/p38 MAPK的信号传递，降低了巨噬细胞中脂多糖诱导的一氧化氮和活性氧（ROS）的生成，抑制TNF-α、IFN-γ等炎性因子的产生，说明人参皂苷可抑制肺部炎性疾病。人参皂苷-Rh4＿qt属于人参三醇型热裂解皂苷[30]，能够抑制H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠的瘤生长，是一种有开发潜力的免疫佐剂[31-32]。β-谷甾醇与豆甾醇均为植物甾醇，具有抗炎、抗氧化等作用[12]，均被应用于肺部疾病的治疗与研究。
在药物-活性成分-靶点网络图中，可以得出最关键的靶点是ESR1、ESR2、CYP19A1、PTPN1等。雌激素受体（ESR）属于一类配体活化的转录调节因子，属核受体超家族成员，包括ESR1和ESR2两种亚型，二者的结构相似，位于细胞核内，介导雌激素的基因型效应，即通过调节特异性靶基因的转录而发挥“基因型”调节效应。在机体内的分布具有组织/细胞特异性[33]。CYP19A1酶催化许多与药物代谢和合成胆固醇、类固醇和其他脂质有关的反应。CYP19A1基因相关的表型揭示了雌激素不但在生长或分化中起着重要作用，对心血管系统也具有一定的保护作用[34]。PTPN1是蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白家族的成员之一，可特异性地催化酪氨酸残基上磷酸单酯的水解，调节细胞生长、分化、有丝分裂周期和致癌转化在内的各种细胞过程。PTPN1是胰岛素信号传导的负调节剂，可在细胞生长控制和细胞对干扰素刺激的反应中发挥作用[35]，因此，PTPN1与癌症、糖尿病等疾病相关[36]。由核心组方中药物-活性成分-靶点网络图可见，核心组方在治疗温病的过程中具有多靶点、多通路、多系统的特点。
GO生物过程富集分析显示，新处方主要涉及蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、核受体活性、配体激活的转录因子活性等方面，潜在的作用靶点主要位于膜筏、膜微区、膜区等位置。KEGG富集分析发现，新处方核心成分主要与神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、c AMP信号通路、MAPK信号通路相关。神经活性配体-受体主要是神经活性配体和受体的相互作用，是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体的集合[37]。钙信号通路潜在靶点以肾上腺素能受体和乙酰胆碱受体为主。王晶等[38]研究表明，人参皂苷Re可降低大鼠组织中TRPC1/C3/C6及其下游的Ca N和Ca MKII.δ蛋白的表达，这表明人参皂苷可能通过抑制TRPC进一步下调下游的钙信号通路相关蛋白。神经活性配体-受体相互作用和钙信号通路作用于肾上腺素能受体和乙酰胆碱受体，从而发挥抗炎作用。除此之外，神经活性配体-受体相互作用可以调节疼痛[39-40]，钙信号通路基因与多种免疫细胞密切相关[41]。c AMP信号通路与气道平滑肌的收缩有关[42-43]。王海一[44]验证了槲皮素通过激活c AMP信号通路以及调控FOS、JUN、RORC等基因对细胞损伤具有保护作用。研究发现，c AMP/MAPK信号通路对炎症因子、肿瘤细胞、神经元等均有一定的调控作用[45-49]。
本文采用TCMICS对吴鞠通《温病条辨》中应用人参方药治疗温病的配伍规律进行梳理归纳，为人参相关组方提供了数据佐证，并结合网络药理学分析，推测了核心组方中的活性成分及主要信号通路，用现代技术研究了与人参配伍方药的组方规律，为人参方药治疗温病提供更详细充分的理论基础。
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文字：[1]刘冬雪,林春盛,王佳婧,孙兴华,逄静,王曼玉... & 张福利.(2024).基于数据挖掘和网络药理学研究《温病条辨》中人参方药治疗温病的用药规律.实用药物与临床(11),815-823.doi:10.14053/j.cnki.ppcr.202411003.；版权归相关权利人。
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