神经元基因经常发生因选择性剪接而包含微外显子（microexons）的情况，这些序列的功能在很大程度上是未知的，但微外显子包含程度的变化与神经发育疾病有关。例如，患有特发性自闭症谱系障碍【1】的个体和患有精神分裂症【2】的个体出现CPEB4中微外显子me4（microexon 4）的包含程度降低。CPEB4是RNA结合蛋白，属于细胞质多聚腺苷酸化元件（CPE）结合蛋白家族（CPEBs），其家族成员在转录本的3’-UTR识别CPEs，并介导其多聚腺苷酸化和脱腺苷酸化，进而通过翻译调控核糖核蛋白复合物的组装来调节翻译。CPEBs参与mRNA的运输和定位，在细胞分裂、神经发育、学习和记忆中起重要作用。CPEBs的羧基末端RNA结合结构域是球形的，而氨基末端结构域（NTD）本质上是无序的。此外，在细胞周期中，ERK2和CDK1对CPEB2-CPEB4 NTDs的多个丝氨酸和苏氨酸残基进行磷酸化，通过溶解其形成的翻译抑制凝集物来激活这些蛋白质【3】。神经元CPEB4（nCPEB4）的靶点包括许多ASD相关基因编码的转录本。表达CPEB4缺失me4的小鼠模型重现了ASD患者中mRNA多聚腺苷酸化和蛋白质表达的缺陷，并显示出ASD样神经解剖学、电生理学和行为学的表型【1】。虽然CPEB4的错误剪接与疾病有关，但为什么需要me4微外显子，以及其包含程度的微小变化如何对ASD连锁基因的表达产生显性负面影响，目前尚不清楚。近日，来自西班牙巴塞罗那科学技术学院的Raúl Méndez 和Xavier Salvatella 团队合作在Nature杂志上发表文章Mis-splicing of a neuronal microexon promotes CPEB4 aggregation in ASD，揭示nCPEB4形成凝集物，由于细胞内pH值的变化改变稳定凝集物的相互作用平衡，在神经元去极化后溶解，这一转变与从翻译抑制到激活的转变有关。神经元样细胞中me4含量的减少增加翻译抑制凝集物转化为聚集体的倾向，这些聚集体在去极化后不会溶解，并在转基因小鼠的大脑中积累。机制上，me4微外显子和组氨酸残基簇的异型相互作用通过与组氨酸簇之间的同型相互作用竞争来防止CPEB4的不可逆聚集。即神经刺激诱导CPEB4介导的基因表达，而这一过程需要微外显子me4来可逆性调节nCPEB4的激活。研究人员首先构建了mEGFP-CPEB4表达小鼠，观察神经元中内源性CPEB4。CPEB4在神经元的细胞质中呈现颗粒状分布，类似凝集物。过表达全长或者NTD的nCEPB4都能促进神经元中凝集物的形成。利用KCl诱导神经元去极化，导致凝集物的溶解，且这个溶解过程不受nCEPB4磷酸化或钙信号的调节。进一步研究发现，nCPEB4凝集物在溶解前通过尺寸增长对去极化做出反应，其动力学与pH值变化的动力学相似。神经元的去极化会导致pH值发生变化，先降低约0.08单位，持续时间约10min，然后缓慢增加0.3单位。pH值的变化会影响nCPEB4以及NTD凝集物的形成。将NTD的组氨酸残基进行突变会降低凝集物的凝集特性。这表明，组氨酸残基的芳香族特性决定了nCPEB4-NTD的凝集倾向，这可能是由于它们能够与芳香族和带正电荷的残基相互作用。核磁共振光谱显示，nCPEB4-NTD的凝集是由组氨酸和精氨酸侧链之间的相互作用驱动的，包括HClust（残基229-252，富含组氨酸）和me4（残基403-410，富含精氨酸）这两个区域间的相互作用，缺失突变这两个区域会减少多聚化和凝集特性。相比于nCPEB4，缺失me4（nCPEB4Δ4) 会导致凝集物形成减少，但两者与蛋白质的相互作用以及与RNA的结合都类似，这表明其形成凝集物的特性是与序列本身有关。进一步研究显示，me4的序列特性在动力学上稳定nCPEB4的翻译-抑制凝集物来对抗HClust驱动的聚集，这有助于其在去极化后的溶解。之前的研究显示，当nCPEB4和nCPEB4Δ4在神经元中共表达时，nCPEB4Δ4摩尔分数的小幅增加可能会对ASD中nCPEB4调节的mRNA的翻译产生显著的负面影响。分子机制的研究表明，nCPEB4和nCPEB4Δ4共定位，并有类似的动力学和分配系数。由于nCPEB4和nCPEB4Δ4混合物聚集的倾向取决于可用于同型相互作用的组氨酸簇的浓度，me4通过与这些簇相互作用，从而与同型相互作用竞争，那么同型相互作用组氨酸簇的浓度就随着me4的包含程度而降低。然而，这种依赖性是S形的，因此表明约60%的夹杂程度是必要的，才能保持凝集物的液体特性和凝集的可逆性。研究从TgCPEB4Δ4转基因小鼠和对照小鼠的大脑中提取的CPEB4的体内构象，发现TgCPEB4Δ4小鼠的脑中存在更多的SDS抵抗型的CPEB4聚集体，且这种稳定的高分子量聚集体对蛋白酶K具有抗性，而对照组小鼠的CPEB4则保持可溶解特性。在体检测也显示TgCPEB4Δ4小鼠的脑中存在CPEB4凝集物聚集的迹象。研究结果显示，me4的精氨酸残基与HClust的组氨酸残基之间的相互作用，对凝集物的稳定具有重要作用。这就提示，如果降低凝集物中可用HClust的浓度即可抑制聚集。研究人员就设计了一种合成肽，其中包含me4序列的两次重复，来探究其对凝集物的影响。首先，合成肽能够掺入到凝集物中，增加其热动力稳定性，降低聚集体产生。将1摩尔的合成肽加入到nCPEB4Δ4-NTD样本中可完全恢复凝集物的可逆性溶解-凝集特性。综上所述，这项研究揭示了微外显子me4如何确保神经元中CPEB4正常功能的调节，并阐释了为什么me4在ASD的包含程度降低会导致CPEB4活性的降低，同时设计了促进CPEB4聚集体溶解的合成肽，为靶向治疗提供参考。原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-08289-w
制版人：十一
1. Parras, A. et al. Autism-like phenotype and risk gene mRNA deadenylation by CPEB4 mis-splicing. Nature 560, 441–446 (2018).
2. Ollà, I. et al. Pathogenic mis-splicing of CPEB4 in schizophrenia. Biol. Psychiatry 94, 341–351 (2023).
3. Guillén-Boixet, J., Buzon, V., Salvatella, X. & Méndez, R. CPEB4 is regulated during cell cycle by ERK2/Cdk1-mediated phosphorylation and its assembly into liquid-like droplets. eLife 5, e19298 (2016).
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