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摘要：随着双特异性抗体（bsAbs）在肿瘤免疫、自身免疫疾病等领域的应用激增，如何高效生产并筛选大规模bsAb分子库成为行业焦点。本文系统综述了五大高通量（HTP）生产策略，包括链配对技术、单链/双链设计、抗体片段组合、化学偶联及氧化还原重组技术，并探讨了其在不同研发阶段的应用潜力。通过自动化平台与质谱分析技术的结合，bsAb研发周期有望缩短50%，为下一代抗体药物的快速开发铺平道路。
双特异性抗体：为何成为“下一代抗体药物”的核心？
免疫细胞重定向：如靶向CD3（T细胞）与肿瘤相关抗原（TAA）的bsAb，可激活T细胞杀伤肿瘤（如已上市的Blincyto®）。 信号通路协同阻断：如同时靶向EGFR和MET的Amivantamab，克服单靶点耐药。 双表位增强结合：如针对HER2的双表位抗体可诱导受体聚集和内吞，增强疗效。
生产复杂性：四链（HC-HC和HC-LC）正确配对困难，产物纯度低（通常仅12.5%）。 筛选效率低：早期需从数万种组合中筛选功能性分子，传统方法耗时耗资。
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图1：bsAb研发流程与高通量技术适用阶段。
五大高通量生产策略：从“手工作坊”到“工业化流水线”
1.链配对技术：优化IgG样bsAb的组装
经典技术：Knob-in-Hole（KiH，凹凸互补）、电荷对设计（如Genentech的CrossMab）。 案例：罗氏开发的CrossMab技术通过交换Fab区CH1-CL结构域，实现HC-LC正确配对，成功用于Glofitamab（CD20×CD3 bsAb）生产。
局限：需多步纯化去除同源二聚体杂质，通量受限（<100分子/批次）。
2.单链/双链设计：简化分子架构
单链格式：串联结构（如BiTE、Tandem scFv），仅需单一表达载体。 双链格式：对称扩展IgG（如IgG-(scFv)₂），通过附加结构域增强功能。
局限：稳定性与免疫原性风险较高，需后期优化。
3.抗体片段组合：“乐高式”模块化组装
案例：Fab-Kp-Fab平台可生成>1000种bsAb矩阵，用于表型筛选发现新靶点组合。
局限：产物含非天然连接结构，需后期转换至最终格式。
4.化学偶联：精准“点击”组装
案例：通过“再桥接”马来酰亚胺试剂稳定Fab-Fab偶联，产率高达85%。
局限：需去除未反应片段，后期开发需转至IgG样格式。
5.氧化还原重组：天然IgG样bsAb的规模化生产
案例：Amivantamab（EGFR×MET bsAb）通过FAE技术从40种组合中筛选出最优分子。
局限：需精确控制还原条件，仅适用于IgG4亚型。
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图2：主要bsAb格式及生产方法示意图。
高通量质谱分析：bsAb纯度与质量的“守门人”
反相色谱-质谱联用（LCMS）：在变性条件下分离杂质，定量正确产物（精度>90%）。 天然质谱（Native MS）：保持bsAb天然构象，分析聚集与碎片化风险。 超高通量质谱（如RapidFire-Orbitrap）：15秒/样本的速度实现糖型分辨，支持千级面板快速筛查。
未来展望：自动化与AI驱动的bsAb2.0时代
全自动化平台：整合质粒构建、瞬时转染、纯化与质谱分析，实现“样本进-数据出”的流水线（如Phynexus Phytip®系统）。 机器学习辅助设计：通过大数据训练模型预测bsAb结合活性、稳定性与免疫原性，减少实验筛选量。 新型格式探索：如三特异性抗体、抗体-药物偶联物（ADC）与细胞疗法联用，拓展治疗边界。
表1：IgG样bsAb的液相色谱-质谱联用分析方法。
结论
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