引言：双特异性抗体（bispecific antibodies, bsAbs）是一类能够同时靶向两个不同抗原表位的治疗性抗体。相较于传统单克隆抗体（mAb），bsAbs在肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病和感染性疾病中展现出更高的特异性和更低的副作用风险。截至2025年，全球已有14款bsAb药物获批上市，另有数百种处于临床前研究阶段。然而，bsAb的复杂结构（图1）使其下游纯化面临巨大挑战：
产物相关杂质（如同源二聚体、片段污染物、聚集体） 工艺相关杂质（如宿主细胞蛋白、病毒、内毒素）
一、捕获层析：从Protein A到新型技术
1.1 传统亲和层析：Protein A的黄金标准
动态结合容量：58–74 mg/mL（2–4分钟停留时间） 优化案例：使用MabSelect SuRe LX捕获非对称IgG样bsAb，载量30 g/L时回收率达94.2%
酸性洗脱条件（pH 3.6）可能导致抗体变性 树脂成本高昂，且对非IgG样bsAb无效
1.2 非Fc依赖型捕获技术
Protein L：结合κ轻链可变区（VL） KappaSelect/LambdaFabSelect：特异性结合κ或λ轻链恒定区（CL）
1.3 混合模式层析：新一代捕获方案
Capto MMC：阳离子交换+疏水作用，可同时去除宿主细胞蛋白（HCP）>60% 仿生小肽配体：如Ac-PHQGQIHGVSK，纯度98%且洗脱条件温和（pH 5.0）
膜层析技术（如Sartobind® Protein A）将工艺时间缩短70% 连续流工艺结合数字化孪生技术，实现端到端连续生产
二、产物相关杂质去除策略
2.1 同源二聚体：结构错配的克星
2.1.1 亲和层析差异化捕获
Fc修饰策略：如DuetMab平台中，通过Fc突变使同源二聚体（FcFc*）无法结合Protein A VH3靶向树脂：MabSelect VH3可区分VH2-VH3 bsAb与VH2-VH2同源二聚体（图5B）
2.1.2 离子交换层析电荷调控
弱分配模式：通过调节pH使bsAb（pI 8.94）与同源二聚体（pI 7.99）分离，去除率>99% 案例：POROS 50HQ阴离子交换树脂在pH 6.0–6.2条件下实现高效分离
2.1.3 混合模式层析多维分离
Capto MMC ImpRes：通过线性pH梯度（5.5–10.0）洗脱孔-孔同源二聚体，残留量<1% Toyopearl MX-Trp 650M：利用盐梯度特异性洗脱λ-λ和κ-κ同源二聚体
2.2 片段杂质：从半抗体到单臂片段
2.2.1 亲和层析精准去除
半抗体：利用Protein A层析结合线性pH梯度（5.5–2.8），NaCl增强分辨率 轻链缺失片段：Capto L层析通过pH梯度（5.0–3.2）去除82.5%杂质
2.2.2 混合模式层析高效精纯
Capto Adhere ImpRes：在高载量（60 mg/mL）下仍保持85.9%去除率 双梯度优化：pH-盐双梯度（pH 6.0–8.5 + 0–250 mM NaCl）使单臂片段去除率提升至66%
2.3 聚集体：免疫原性的隐形杀手
2.3.1 亲和层析洗脱优化
添加剂策略：5% PEG + 500 mM CaCl₂洗脱液将聚集体含量从20%降至3–4% Protein L层析：100 mM Arg-HCl洗脱液使聚集体减少59.4%
2.3.2 混合模式层析多维清除
Capto MMC：线性梯度洗脱后聚集体残留仅0.7% Diamond MMC Mustang：阶梯盐梯度洗脱纯度提升至97.4%
三、工艺相关杂质清除技术
3.1 宿主细胞蛋白（HCP）
3.1.1 层析与深度过滤联用
Protein A优化：高pH洗脱液（pH >4.5）结合添加剂（如精氨酸）降低HCP共洗脱 深度过滤：纤维素基材通过尺寸排阻和吸附去除沉淀HCP，LRV >2
3.1.2 上游工艺联动
辛酸预处理：Protein A前加入辛酸沉淀，HCP去除率提升2个对数级
3.2 病毒安全：从灭活到过滤
3.2.1 低pH灭活
条件优化：pH ≤3.8、30分钟孵育，脂包膜病毒（如X-MuLV）灭活率≥4.6 LRV
3.2.2 层析与膜过滤
阴离子交换层析：流穿模式下X-MuLV和MVM去除率分别达4.22和3.25 LRV 病毒过滤器：Planova™ 20N（PES膜）对细小病毒（18–26 nm）截留率>4 LRV
3.3 内毒素：电荷差异的利用
阴离子交换层析：DEAE树脂在低电导（<50 mM NaCl）下吸附内毒素（pI≈2），去除率>5 LRV 添加剂干预：烷烃二醇可破坏内毒素-抗体复合物，提升阳离子交换效率
四、工艺整合与未来展望
4.1 经典流程 vs 创新模式
传统流程（图7A）：Protein A捕获 → 低pH灭活 → 离子交换精纯 → 病毒过滤 混合模式替代（图7B/C）：Capto MMC可替代多步层析，降低成本并提升效率
4.2 技术前沿：数字化与连续生产
AI模拟层析机制：深度学习预测蛋白质-树脂相互作用，优化洗脱条件 连续流工艺：数字化孪生技术实现实时监控，批次损失降低30%以上
五、结语
识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！
