在过去的几十年里，小干扰RNA（siRNA）作为一种革命性的基因沉默工具，在精准医疗领域展现了巨大的潜力。它能够特异性地靶向并抑制特定基因表达，为许多难治性疾病提供了新的治疗思路。
然而，将siRNA成功应用于临床实践并非易事，尤其是对于非肝脏组织而言，其递送效率和安全性面临着诸多技术性障碍。尽管GalNAc修饰的siRNA已经实现了对肝细胞的有效靶向，但对于其他器官和组织来说，如何确保siRNA能够稳定存在、高效递送并准确作用于目标细胞，依然是亟待解决的关键问题。
随着科学技术的进步，科学家们正在探索一系列创新性的递送策略，用于克服这些瓶颈，开启siRNA药物从肝脏到全身治疗的新篇章。
图1. Gene therapy strategies[4]
siRNA药物的一个关键挑战在于如何有效地将其递送到目标细胞中。由于siRNA分子带负电荷且相对较大，它们难以穿透细胞膜进入细胞内部发挥作用。此外，siRNA在血液中容易被核酸酶降解，导致其半衰期短；并且它们可能会被网状内皮系统（RES）快速清除或与血清蛋白结合而失去活性。
为了克服这些问题，研究人员开发了多种递送技术，例如：脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物载体和其他类型的纳米材料，但这些载体可能存在安全性或者制造成本高昂的问题。特别是对于非肝脏组织，siRNA从内吞体逃逸到细胞质的过程更加困难，因为大多数细胞表面受体的数量远低于肝细胞上的唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），后者能够帮助GalNAc修饰的siRNA高效地进入肝细胞。
siRNA进入血液循环后，将面临多种挑战。首先，siRNA分子很容易被血浆中的核酸酶识别并迅速降解。这些核酸酶广泛存在于血浆和其他体液中，能够快速切割外源性的siRNA，从而大大缩短了其在体内的有效时间。其次，siRNA可能与血清蛋白发生非特异性结合，形成复合物后会被肝脏、脾脏等器官中的单核吞噬细胞系统（MPS）所捕获，进一步减少了其到达目标组织的数量。
即使siRNA能够成功地达到目标组织附近，进入细胞内部也是一个复杂的过程。大多数细胞表面缺乏足够的受体来高效地摄取siRNA，尤其是在非肝细胞中，这种情况更为明显。例如，肝细胞表面高度表达的唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）可以有效地帮助GalNAc修饰的siRNA进入细胞，但在其他类型的细胞上，类似的受体数量极少，使得siRNA很难通过传统的受体介导的内吞途径进入细胞。即使siRNA被细胞内吞，也面临着从内吞体逃逸到细胞质中的难题，这是实现基因沉默效应的关键步骤。然而，对于许多非肝细胞而言，这一过程效率极低，限制了siRNA的效果。
除了上述问题之外，siRNA药物还需要具备良好的靶向性，即能够在体内特异性地定位到病变部位，并在那里释放出足够的剂量以产生治疗效果。然而，当前的递送技术往往难以精确控制siRNA的分布模式，导致药物可能分散到非目标区域，增加了脱靶效应的风险，同时也浪费了宝贵的药物资源。
siRNA需要具备良好的体内性能，包括稳定性、持久的效果及安全性。化学修饰是提高siRNA稳定性和减少副作用的关键手段之一。通过引入如2'-O-甲基化、2'-氟代等修饰，可以增强siRNA对核酸酶的抵抗力，延长其在体内的存留时间。
此外，某些修饰还可以改善siRNA的药代动力学特性，比如增加其水溶性或改变电荷分布，使得siRNA更容易被目标细胞摄取，并且一旦进入细胞内部，也更有可能逃脱内吞体/溶酶体而到达作用位点。但是，即使有了改进，siRNA仍然可能面临来自血浆、组织和细胞质中的核酸酶或磷酸酶的快速降解风险。
尽管化学修饰为siRNA带来了诸多好处，但在实际应用中，仍然需要面对来自血浆、组织和细胞质中的核酸酶或磷酸酶所带来的快速降解风险。因此，开发出既能保证足够长的作用时间又能确保安全性的siRNA至关重要。持久的效果意味着一次给药后可以在较长时间内维持有效的基因沉默水平；而安全性则涉及到避免不必要的免疫反应和其他潜在毒性问题。
免疫原性与脱靶效应是siRNA药物开发过程中必须面对的重要挑战。外源性的寡核苷酸，如siRNA，由于其非自身来源的特性，可能会被机体识别为外来物质，从而引发一系列免疫反应。这种免疫原性不仅可能影响siRNA药物的效果，还可能导致不良反应，甚至威胁患者健康。
与此同时，siRNA药物在体内也可能出现脱靶效应，即siRNA除了作用于预期的目标基因之外，还会意外地影响其他不相关的基因表达，进而造成不必要的副作用或毒性。
图5. Solid-supported oligonucleotide synthesis and siRNA drug Givosiran[4]
为了降低siRNA的免疫原性的发生概率，科学家们引入了多种化学修饰技术。例如，2'-O-甲基化、2'-氟代（2’-F）、磷硫酰化（PS）等修饰，可以增强siRNA对核酸酶的抵抗力，延长其在体内的存留时间，同时也能改变siRNA的物理化学性质，使其更难被免疫系统识别。此外，GalNAc-siRNA缀合物的应用实现了高效的肝实质细胞靶向，减少了非特异性结合的可能性，从而进一步降低了免疫原性和脱靶效应的风险。
尽管上述改进措施已经在很大程度上改善了siRNA药物的性能，但它们的毒性和免疫原性仍然是临床前和临床研究中需要仔细评估的问题。这是因为每个患者的个体差异可能导致不同的免疫响应，而且某些修饰可能会引入新的潜在风险。
因此，在将siRNA药物推向市场之前，必须进行全面而深入的研究，确保其安全性和疗效都达到了预期标准。这包括但不限于检测抗药物抗体（ADA）的产生情况、监测免疫激活指标的变化、观察长期使用的安全性等。
对于非肝脏组织而言，siRNA药物的递送面临着显著的技术挑战。尤其是当涉及到siRNA从内吞体逃逸到细胞质的过程时，这一过程在非肝细胞中显得尤为困难。这主要是因为大多数非肝细胞表面受体的数量远低于肝细胞上的唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），后者能够帮助GalNAc修饰的siRNA高效地进入肝细胞，而在其他类型的细胞上，类似的受体数量极少，导致siRNA难以通过传统的受体介导的内吞途径进入细胞。
首先，靶向性不足是siRNA递送至非肝脏组织的主要障碍之一。与肝脏相比，许多非肝组织缺乏足够的特异性受体来促进siRNA的摄取。例如，中枢神经系统（CNS）中的血脑屏障（BBB）对大多数物质构成了强大的物理和化学障碍，使得siRNA很难穿透并到达目标神经元或胶质细胞。同样地，心脏、肺部等重要器官也各自拥有一套复杂的防御机制，限制了外来分子的进入。
其次，即使siRNA成功被非肝细胞摄取，它仍然需要克服内吞体逃逸效率低下的问题。研究表明，在非肝细胞中，只有不到1%的siRNA可以从内吞体逃逸，而被动siRNA逃逸率更是小于0.01%。这意味着大部分siRNA会在内吞体内被降解，无法到达细胞质发挥其基因沉默功能。
此外，不同类型的细胞具有不同的生理特性，这也增加了siRNA递送的复杂性。例如，某些细胞可能表达较低水平的目标受体，或者它们的胞吞作用机制不同于肝细胞，从而影响siRNA的摄取效率。
鉴于上述挑战，开发适用于不同器官和组织类型的高效递送系统成为了当前研究的重点之一。为了应对这些难题，科学家们正在探索多种创新策略。首先是利用外泌体作为载体，外泌体是由活细胞分泌的小型囊泡，它们天然存在于各种体液中，并且可以携带生物活性分子穿越生物屏障。因此，使用外泌体作为siRNA递送载体被认为是一种有潜力的方法，尤其是在针对CNS疾病方面。研究表明，经过工程改造后的外泌体不仅能够绕过BBB，还能特异性地靶向病变区域内的特定细胞类型。
其次是亲脂性缀合物的应用，鞘内或脑室内递送的C16-siRNAs可以在不同的中枢神经系统区域和细胞类型中表现出活性，而且RNAi活性持续至少3个月。类似地，玻璃体内给药到眼或脊髓也可以实现局部siRNA治疗效果。这种方法依赖于siRNA与长链脂肪酸或其他亲脂性分子的结合，以促进其跨膜运输。
最后是选择性器官靶向（SORT）技术：德克萨斯大学的研究团队提出了一种基于SORT siRNA脂质纳米颗粒的新方法，旨在将RNAi疗法扩展至全身静脉给药后可靶向的非肝组织。该技术通过优化LNP配方，使其能够在血液循环中保持稳定，并最终定位于特定的非肝组织，如肿瘤组织或其他病灶部位。
siRNA药物的发展不仅标志着基因疗法的一个重要里程碑，同时也揭示了未来个性化医疗的巨大潜能。面对siRNA递送过程中遇到的各种挑战——包括体内稳定性差、容易被核酸酶降解、可能引发免疫反应以及脱靶效应等问题，研究人员通过引入化学修饰、开发新型载体材料如脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物载体及外泌体等手段，显著提高了siRNA药物的安全性和有效性。特别是针对非肝脏组织递送的技术难题，诸如选择性器官靶向（SORT）技术和亲脂性缀合物的应用，正逐步打破传统限制，为更广泛的疾病治疗开辟道路。
随着更多研究的深入和技术的成熟，我们有理由相信，siRNA药物将在不久的将来成为一种更为普遍且高效的治疗方式，惠及更多患者群体。
此外，持续关注siRNA药物在整个生命周期内的表现，包括长期使用的安全性和疗效评估，将是确保这一新兴疗法成功走向市场的关键所在。
参考文献：
1.Alterman JF, Godinho BMDC, Hassler MR, A divalent siRNA chemical scaffold for potent and sustained modulation of gene expression throughout the central nervous system. Nat Biotechnol. 2019 Aug
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4.Kumar V, Turnbull WB. Targeted delivery of oligonucleotides using multivalent protein-carbohydrate interactions. Chem Soc Rev. 2023 Feb 20
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