先进治疗药物的制造和质量：细胞疗法、CAR-T和基因疗法

摘要:先进治疗药物包括细胞和基因疗法，这些领域最初是不同的，但现在有时正在汇聚，如CAR-T方法所示。所有先进治疗药物的共同点是，它们的活性药物成分比常见的生物制剂（如抗体）要复杂得多，因此在制造和质量控制方面提出了更高的挑战。我们讨论了先进治疗药物的突出例子及其技术平台，描绘了它们的历史和技术起源以及可能的前进路径，以便理解当今所见的制造过程的演变。重要的是，通过这种方法，我们从过去的经验中吸取教训，目的是引导当前和未来的制造和质量控制专业人员远离可能有问题的方法，而趋向可能成功的方法。鉴于先进治疗药物的复杂性，监管指南也相应发展，我们讨论了当前的状态；我们感到自豪的是，我们和该领域其他人与当局分享的许多经验最终促成了监管指南，如欧盟ATMP指南。最后，我们希望分享我们在尖端科学和生产技术交汇领域工作所体验到的深刻满足感，从而以前所未有的速度提供关键的药物产品，特别是在最近的Covid19大流行背景下。

1.历史

1.1.早期生产要素的发展历史

细胞疗法的最早例子可能是自17世纪以来就众所周知的输血，它们基于Landsteiner在1901年发表的血型发现，这使得输血变得可靠并广泛可用。在最基本的层面上，生产过程仅限于从一个个体——捐赠者那里抽取血液，然后将其注入另一个个体——接受者体内，大规模并以受控方式进行此操作的需求增加了血型分类、微生物控制/测试，重要的是，物流，即储存、运输和标准化处理，这些都属于输血的生产过程；此外，对输血的巨大需求加上战争事件触发了开发工具和流程的爆炸式增长，其中包括标准化的无菌材料，如注射器、袋子和相关产品，最终发展为今天普遍使用的一次性变体，这些也影响了制药和生物技术行业的许多领域的工具和流程。

1.2.骨髓移植

自20世纪40年代以来，已有骨髓移植的报道，目的是为患有血液系统疾病（如白血病）的患者提供治疗。与输血的发展见解类似，只有在建立了理论基础之后才取得了临床成功；在这里，这包括了对捐赠者和接受者必须根据人类白细胞抗原（HLA）系统进行匹配的理解。在此之后，自20世纪60年代末以来已有成功的骨髓移植报道，某些由血液系统细胞引起的癌症变得可以治疗。该过程首先包括获取捐赠者的骨髓活组织检查，例如，通过从髂骨的骨髓腔中抽取，富集造血干细胞样本，冷冻保存移植，对患者进行调理，将移植在低温条件下运送到患者所在地，控制条件下解冻移植并输注移植。在最基本的层面上，该过程包括了上述输血描述的过程，以及所需的冷藏/冷冻保存移植及其在低温/冷冻条件下的运输，以及在输注前控制解冻的步骤。随后，通过表面抗原识别了造血干细胞，从而可以表征、量化并进一步纯化骨髓移植中负责再生血液系统的细胞部分，即实际的活性成分；这些细胞根据在血液谱系中使用的分化群术语，被广泛称为CD34阳性细胞。与上述输血情况类似，可靠地进行骨髓移植的能力触发了支持这些新需求的设备的开发，特别是改进的采集设备、富集程序和设备、冷冻配方、控制速率冷冻设备、改进的冷冻储存单元和基于HLA的测试设备。

1.3.生物生产贡献

在20世纪70年代，人们可以重组生产蛋白质，胰岛素是一个早期和突出的产品。为生物生产开发的许多工具直接关系到细胞和基因治疗产品的工业生产，因此将详细讨论。虽然在微生物中生产的重组蛋白质的可用性是一个巨大的成功，但很快就变得明显，微生物表达系统受到严重限制，因此研究人员转向了哺乳动物表达系统。这些细胞最初是贴壁细胞，因此需要表面才能附着以生存、增殖并合成感兴趣的蛋白质。最初的培养可能发生在典型的实验室规模的细胞培养设备中，如T-Flasks。鉴于它们的表面积有限，通常为225平方厘米及以下，这些很快就变得有限，因此开发了具有简化操作的大型格式。这些的著名例子是细胞工厂/细胞堆叠，包括1-40层细胞生长区域并入1个设备中，中央供料和通风，以便可以通过例如通过一个开口将所需体积/滴度泵入堆叠中来将细胞悬浮液播种到这样的堆叠中。关闭开口，并使用0.22微米孔径的适当无菌过滤器排列封闭堆叠，允许通风，并允许堆叠使用常规CO2控制的细胞培养孵化器。各种供应商提供各种尺寸的此类堆叠；出于实际原因，通常使用10堆叠及更小的手动操作；40堆叠往往需要机械辅助，这些也可以从堆叠提供商那里获得。应当注意，来自此类堆叠的产量并不一定线性放大。将多个生长表面堆叠在一起并整合到一个设备中的原则，已经衍生出各种变体，这些变体具有改变的几何配置、提高的吞吐量和体积以及特定应用。生物生产早已超越了为贴壁细胞培养设计的堆叠系统，采用了目前最高达2立方米的一次性悬浮式生物反应器，并与完全合成的培养基一起使用。因此，基于血液学需求的治疗方法为基于活细胞的工业化治疗提供了关键方面的工具箱，尽管规模较小。生产规模是任何药物可用性的重要参数，包括基于细胞的治疗，来自生物生产的适应提供了此类放大的工具。

2.干细胞与经验教训

用于治疗目的的各种细胞类型已经被讨论，其中包括胚胎干细胞。这类胚胎干细胞的魅力部分在于这些细胞能够发育成身体的所有组织，因此人们假设它们也可能能够再生身体中所有患病的组织。这种观点可能影响了对许多其他用于治疗目的的细胞类型的考虑，导致了有时过于夸张的声明组合：它们的干细胞特性将使这些细胞能够归巢到受损组织并在那里整合，从而修复有缺陷的组织，并且能够避免被接受者的免疫系统识别和清除——本质上是具有广泛治疗潜力的自我引导的备用部件。这些概念的一个后果是对“干细胞特性”的关注，因为它被认为是细胞治疗效果的关键。因此，有时甚至延续到今天，干细胞特性测试仍然是具有某种可塑性的细胞的放行标准。虽然有针对干细胞特性的细胞生物学测试，但测试这些特性与一个明确的作用机制和相关的定量测试大不相同，我们认为它与治疗效果的关系充其量是微弱的。例外的观点是诱导多能干细胞，然而，它们本身并不是一种药物产品，而是理想细胞类型的前体。许多细胞类型在治疗性细胞的背景下被讨论，并应用于广泛的适应症；单独考虑它们是不切实际的，因此下面我们讨论血液和非血液来源的治疗性细胞类型的例子，并从后者开始；间充质干细胞可能作为治疗性有价值细胞的原型，并可能用来说明制造步骤、陷阱和解决方案。

3.间充质干细胞

间充质干细胞，有时也被称为间充质基质细胞（MSCs），最初由Friedenstein等人描述，并后来被提议作为新型细胞治疗学的基础。它们是从骨髓、脂肪或脐带等组织中提取的成纤维细胞。从这些组织中可以生成粗细胞制备物，并将其种植在静态培养表面上，例如T型瓶。这些细胞制备物包含增殖和静止的、以及粘附和非粘附细胞的混合物。在标准培养条件下，MSCs会粘附并增殖，以至于例如三次换液就足以去除非粘附细胞；在剩余的分数中，在适当的生长因子存在下，MSCs往往是唯一的增殖细胞，以至于这样的培养在大约2周后主要由MSCs组成。然后可以通过常见的细胞培养扩增协议来扩展这样的初始MSC培养——收获、分裂、重新种植和重复循环。

3.1.一个案例：基于MSC的研究性药物产品

我们认为上述与干细胞相关的误解可能导致了基于MSC治疗的发展的重大后果，我们不仅基于个人经验，还基于出版物、临床试验和批准产品之间的关系来支持这一点。人们完全期望有一个时间顺序，首先是出版物，然后是临床试验，然后是批准的产品；同样，人们期望临床试验有时会持续相当长的时间，以至于上述时间顺序可能被拉长。尽管如此，考虑到图15.1中提供的数据，即近1500项临床试验，并考虑到批准产品的数量很少，即在本文撰写时的9个（https://alliancerm.org/available-products/），我们建议这些数字表明了努力和成功之间的不幸比例，并认为一个可能的根本原因可能基于上述考虑：坚持对细胞能力的夸张声明而不是相关的和定量的功能规范可能导致了负担过重的研究性药物产品，因此没有达到预期；最终这可能导致了大量的不确定的临床试验。我们强调这一点，因为我们认为这是当前和未来使用细胞/组织工程/基因治疗研究性药物产品的一个关键教训：为了最大化成功的可能性，我们认为坚持理性和定量的产品考虑和规范至关重要。

图15.1 每年发布的MSCs出版物和临床试验的数量；数据来源于2023年1月对www.clinicaltrials.gov和medline.com的查询。临床试验和出版物的总条目数分别为1457和75,342。数据来自2023年1月的网站clinicaltrials.gov和pubmed.com。我们假设与庞大的临床试验体量相比，产品的数量是低的。

3.2.第一代MSC产品和制造过程：静态/平面培养系统

生产通常发生在静态/平面培养系统中，即最初在T型瓶中，随着细胞数量的增加，转移到上述多层堆叠系统中，因为这些系统提供了从T型瓶的直接放大，无需专门的和昂贵的设备，超出了通常在进行细胞培养的实验室中发现的设备——通常是新治疗发展的起源地。使用这种培养系统，既可以满足分析需求，也可以满足初始生产需求——对于分析要求，每样本需要少量细胞通常就足够了，而且需要许多倍数，通常发现96孔板，每个孔有大约0.3平方厘米的生长面积和高达例如2000个细胞是有用的，并且与分析设备如分光光度计或荧光计兼容，以便可以快速获取许多数据点；对于特殊应用，使用更密集的格式如384孔板可以实现更高的吞吐量。对于生产目的，通常需要大量的细胞。一个10层堆叠提供大约6600平方厘米的生长面积，这可能产生150-200×10^6 MSCs；这相当于通常用于单一成人剂量的MSC数量，因此人们可能会计算每剂1个10层堆叠。

在这些静态/平面系统中，细胞扩增的本质是最初种植少量细胞，并让它们增殖直到达到所需的细胞密度；在这段时间内，进行换液可能是有益的。一旦达到所需的密度，可以通过去除培养基、用缓冲盐水溶液洗涤细胞，然后通过例如酶促切割它们与生长表面的连接来释放细胞，洗涤得到的悬浮液以去除酶，将它们重新悬浮在适当的培养基体积中，并以例如1:5的分裂比例重新种植它们，即把从1个培养容器中收获的细胞数量分配到5个这样的容器中。这个过程可以重复，直到获得所需的细胞数量；在那一点上，细胞可以被准备用于长期储存，即冷冻保存，见下文，或直接应用。

3.2.1.过程考虑

复杂的动物成分

自从Gey实验室最早的细胞培养成功以来，细胞培养基就含有各种复杂的动物源成分，随着时间的推移，添加胎牛血清成为了标准方法。除了关于材料来源的伦理考虑外，由于牛海绵状脑病（BSE）及其人类对应疾病克雅氏病（CJD）的出现，安全性考虑变得至关重要。因此，这种复杂的动物源试剂带来了安全风险，反过来，监管障碍，由于对来源的限制而变得稀缺，并且因此变得昂贵。与生物生产细胞系不同，目前我们不知道有一种完全合成的形成用于贴壁细胞的培养基。到目前为止，牛血清通常被替换为使用人血小板裂解物，它提供了类似的好处，不是（非人类）动物源的，并且有药用质量。含有它的培养基配方通常被称为“无异种”培养基，很可能是当前的首选配方。

细胞年龄/能力

Hayflick在20世纪60年代提出，非癌细胞只能进行有限次数的细胞分裂，并且在尝试生成大量治疗性MSCs时也观察到了这一点。每个细胞种植、培养扩增和收获的周期通常被称为“传代”，本质上是粗略测量特定细胞培养经历了多少次细胞分裂。在扩展的培养扩增过程中观察MSCs时，人们很容易观察到，扩展到更高传代数的MSCs，可能6-10，经常表现出包括改变形态和降低增殖率在内的变化。似乎除了对MSCs在培养中可能经历的分裂次数的任何生物学限制之外，这些现象还受到过程特定参数和事件的影响，其中一些是平面/静态细胞培养固有的。

细胞密度

已经确立细胞密度对细胞增殖和存活有重大影响，并且已建议旁分泌效应是负责的。同样，细胞-细胞接触也被认为是关键的细胞过程的调节器，并且已建议细胞-细胞接触是控制组织内细胞的调节网络的一部分。

在平面/静态培养中，细胞受到细胞密度的反复振荡——它们在每个传代中以低密度种植并以高密度收获，因此反复暴露在类似于增殖率低的协调组织条件下。这种反复暴露可能导致减少甚至没有增殖。

细胞培养基pH值：气体相

当开始培养时，特别是在多层系统中，被动气体交换建立堆叠内部孵化器条件需要时间。这很重要，因为气体混合物，特别是其CO2浓度，决定了细胞培养基的pH值。细胞通常需要其培养基的近中性pH值。使用5% CO2的碳酸氢盐缓冲系统可以完成；空气只含有大约0.04%的CO2，因此基于碳酸氢盐缓冲系统的培养基将在空气中向碱性漂移。许多细胞不容忍这一点，因此，为了迅速建立这些细胞培养系统内所需的条件，这些系统最初可以用适当的气体混合物冲洗，例如含有5% CO2的空气，从而迅速建立所需的气氛和培养基的pH值。

代谢

哺乳动物身体严格控制氧气、葡萄糖、脂质和其他燃料和营养物质以及代谢副产品或废物如氨的水平。疾病中控制失调的剧烈影响，如糖尿病，是众所周知的。然而，在平面/静态培养中，并没有这样的控制，培养基通常是批量喂养的，因此细胞经历燃料和废物浓度的剧烈变化；氨可能特别重要，因为它已知抑制氧化磷酸化，迫使细胞通过效率低得多的糖酵解途径产生能量。

因此，通过平面/静态培养产生的细胞不断受到多种非生理和破坏性因素的影响。考虑到这一点，并且进一步考虑到上述缺乏严格衡量所产生细胞治疗质量的手段，很可能次要参数，如数量，成为了这些过程的主要衡量标准。人们不禁推测，这种情况导致了产品在满足细胞数量规格的同时，可能因缺乏对其治疗效果的控制而受到影响。

3.3.第二代间充质干细胞（MSC）产品和制造过程：生物反应器

我们提到生物生产是细胞治疗制造过程可以建立的工具、过程和设备的来源。一个典型的生物生产过程始于少量细胞，可能是几百万个，这些细胞被解冻、在如摇瓶等小型设备中培养扩增，然后转移到可能高达50升的小型生物反应器中，从那里转移到最终尺寸的生物反应器——目前，高达2立方米。现有的一次性生物反应器主要配置要么是搅拌罐类型，要么是基于摇动的类型。两种类型都已成功制造MSC的报告——在我们手中，搅拌型生物反应器运作良好，无需任何修改。

生物反应器的一个好处是，它们提供了比静态/平面系统更高的控制程度。不仅气体混合物得到了很好的控制，营养物质水平也是如此，因为生物反应器控制设备可以向培养中添加所需的成分。

生物反应器的另一个好处是它们是封闭系统。虽然在过程开始时可能有开放步骤，但这大大减少了与静态/平面培养相比的开放无菌操作数量，因此减少了错误和微生物污染的可能性。

3.3.1.生物反应器中的贴壁细胞

生物生产系统是考虑到悬浮细胞而开发的。正如我们上面讨论的，MSC需要附着表面才能生存和功能，这一差距通过使用微载体来填补；后者也是生物生产工具箱的一部分，尽管来自生产细胞系仍然是贴壁细胞的时代。细胞疗法对微载体的需求引发了新微载体开发的浪潮，因此现在有大量的品种可供选择。在选择微载体时，这些考虑似乎是有用的：

• MSC对剪切应力比较敏感，因此需要将其最小化。剪切应力的一个主要原因是由搅拌器等提供的搅拌。搅拌需要创造一个持续混合的环境，以便细胞能够获得新鲜营养物质，废物得到分散，微载体被悬浮。为了以最小的搅拌实现这一点，可以选择密度与培养基相似的微载体。

• MSC需要合适的附着表面，因此，可以选择支持MSC附着的微载体。

• MSC需要在生物反应器运行结束时收获。因此，应该选择在与高MSC活性兼容的条件下支持MSC释放的微载体。我们使用基于蛋白质的微载体取得了极好的结果，这些微载体可以使用适当的酶进行消化，以便附着在它们上的细胞被释放。

• MSC应该在不含动物成分的培养基中扩增。由于这些成分提供附着蛋白、脂质和生长因子，微载体可能可以提供一定程度的替代，当然对于附着蛋白，但也可能作为脂质和生长因子的缓释源。

• 考虑到这些主题，微载体是制药制造过程的一部分，因此需要是GMP质量的。

3.3.2.细胞年龄/能力

使用带有微载体的生物反应器系统制造MSC消除了传代的概念。同时，描述细胞群体经历的细胞分裂次数的需求仍然存在，因此使用了改进的术语：群体倍增水平（PDL）。这个术语描述了细胞群体在扩增步骤中经历的平均细胞分裂次数。它不仅比传代这个术语更准确，而且也不局限于平面/静态培养系统，因此现在被广泛使用，也在平面培养中使用。它可以按以下方式计算：方程15.1：计算扩增细胞群体的群体倍增水平。N = 扩增结束时的细胞数量；N0 = 扩增开始时的细胞数量。我们提出这个计算是为了强调商业生产中真实细胞年龄的重要性；这个原则可能会被iPSCs和与之相关的在培养中使用单细胞悬浮液的困难重新挑战。iPSCs可能在细胞扩增的延长期间累积遗传变化。

使用PDL，我们手头有了一种普遍可比较的细胞年龄描述，它完全兼容3D培养扩增；值得注意的是，它还允许比较平面/静态和3D培养中细胞制备的分裂次数。

3.3.3.作用模式和相关控制

如上所述，MSC和其他塑料细胞最初被认为是通过它们的“干性”来执行治疗壮举的。在我们看来，这一概念尚未得到证实，因此应该被忽视。同时，已经确立MSC分泌大量的生物活性因子，其中几个已知是再生效应中的关键因素。事实上，MSC不仅分泌许多生物活性因子，还脱落含有生物活性因子、核酸和其他物质的囊泡——外泌体。因此，MSC的作用模式似乎是通过分泌这些因子和囊泡。这些生物活性因子的释放，无论是可溶的还是囊泡中的，都可以量化，因此为细胞制造的定量特征提供了极好的机会。例如，血管内皮生长因子（VEGF）是众所周知的触发新血管形成的关键因素。已知MSC大量产生和分泌VEGF，因此有人建议MSC对于灌注相关适应症的作用模式是释放VEGF，从而触发新血管的形成，以便重新生成灌注。由于必须事先定义生产的细胞所需的功能参数，细胞制造的最小VEGF分泌率可能是针对此类适应症的细胞的一个有意义和定量的规范。

另一个例子是，MSC可能被用来治疗移植物抗宿主病（GvHD），这是一种严重的自身免疫疾病。在这种适应症中，可能的作用机制是通过淋巴细胞介导的免疫系统活动。后者需要氨基酸色氨酸进行其活动和增殖，而MSC已知表达一种分解色氨酸的酶，即吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）。这种酶已被证明需要用于消除排斥反应，因此是一个令人信服的候选物，用于特征化针对此类适应症的MSC。因此，最小IDO活性可能是针对此类适应症的细胞的一个有意义和定量的规范。

我们认为这两个是MSC产品规范的定量和合理的例子，并认为遵循这种逻辑来确定其他适应症的适当规范可能有助于开发成功的相关产品。寻找这种合理和可量化的测试和规范的追求对于先进疗法尤其相关：它们的复杂性远远超过了例如抗体，更不用说小分子。除了上述的功能标记外，在培养扩增过程中，应进行过程控制（IPC），以便于监测培养的进展和活性——特别是在工艺开发过程中。过程控制监测也用于显示批次间的过程一致性，并将需要用于市场应用。这些IPC可能包括：

• 细胞计数——监测细胞滴度，因此监测细胞的扩增。在开发过程中，这提供了有关培养系统能力的信息。类似于微生物系统，细胞应在进入静止相之前收获，或者确实，在它们的活性下降之前。请注意，细胞计数是细胞状态的晚期指标。因此，我们还推荐确定更早的标记：

• 表明细胞溶解的标记。细胞计数是细胞培养中不利事件的晚期指标。在细胞计数下降之前，单个细胞表现出降解的迹象，通常是释放细胞内物质。通常，细胞内酶乳酸脱氢酶在培养基中的活性已被用来衡量细胞降解。甚至更简单的测试确定培养中存在双链DNA，根据我们的经验，这是一个非常有用的工具。

• 代谢标记。通常，测量葡萄糖、乳酸和氨的浓度。葡萄糖是主要的燃料，乳酸是糖酵解的最终产物，葡萄糖消耗和乳酸产生的比率变化可能表明氧化磷酸化不足，这是大多数哺乳动物细胞的主要能量来源。已知氨抑制氧化磷酸化，因此其浓度需要严格控制；它是由例如谷氨酰胺的自发分解或细胞代谢产生的。

3.4.无需扩增的MSC

每个扩增过程都涉及成本、时间和需要监管审查的试剂。因此，考虑不涉及这些方面的方法是有趣的：Ossium Health是一家开发基于MSC的疗法的公司，已经能够通过使用器官移植指导和基础设施，从已故捐献者那里获得更大的MSC丰富组织收集。这种起始材料显然比传统的髂骨骨髓抽吸物更少受到T细胞污染。因此，这个MSC制造过程可能从更多的细胞开始，可能是多达10倍，在其预分化和自然状态，从而大大减少了对体外扩增的需求，例如从3个传代到一个，并可能提供一个受扩增效应影响较小的MSC群体，并可能具有增强的治疗特性。

3.5.第三代间充质干细胞（MSC）产品和制造过程：外泌体和工程化MSC

有大量证据表明，MSC的治疗功效与其分泌物组有关，即它们合成并直接释放到局部环境中的生长因子和细胞因子。与其他许多细胞类型一样，MSC也可以脱落或释放更大的、被膜包裹的囊泡，称为不同大小和名称的细胞外囊泡（EVs、外泌体或微体），这些囊泡也可以将生长因子和细胞因子传递给其他细胞。这一观察解释了为什么有几家公司正在探索从MSC中收集外泌体并以允许目标细胞替代摄取这些信使分子的方式传递这些“包装”的细胞因子。在这种情况下，MSC是幕后的生物工厂，生产药物物质（外泌体），但它们本身并没有被传递给患者。如果EVs的货物特性随着MSC的培养而改变，并且随着细胞群体倍增的增加，特定所需的生长因子或其他信使分子减少，这种方法也可能有局限性。目前，Clinical trial.gov网站列出了296项注册研究使用外泌体，其中只有24项似乎研究来自MSC的外泌体。

在整个这一章中，我们提倡使用合理、可信和定量的措施来衡量细胞的功能与其治疗目标（s）的关系。我们确实认为，遵循上述合理和定量规范的概念可能会导致成功率的提高，应该追求。然而，有一个更直接的方法来确保MSC产生理想的因子——遗传操作。

3.5.1.基因工程化MSC

如上所述，MSC的安全性概况非常好，因此考虑超越“内置”的治疗适应症是诱人的。存在各种技术可以将遗传物质引入哺乳动物细胞，包括电穿孔、逆转录病毒或慢病毒转导，或者更近地使用腺相关病毒，这些技术已被用来增强MSC的治疗概况（表15.1）。

周等人回顾了MSC工程的临床状态，并讨论了5个转导MSC的例子，例如分泌干扰素γ（IFN-γ）以针对卵巢癌。他们还列出了7个Crispr/Cas9修饰的MSC的例子，例如分泌白介素10（IL-10）针对心肌梗死；Crispr修饰的MSC仍然处于研发水平，可能是因为该技术最近才出现。

Damasceno及其同事回顾了MSC转导方法，并列出187篇关于基因修饰MSC的报告；在Medline上搜索Crispr/Cas和间充质干细胞的组合，得到65个条目。不管每种方法的确切数字是多少，它都说明了基因修饰MSC是一个引起极大兴趣的领域，人们可能会推测这些报告中的一部分将进入临床试验。为了确保这些产品能够进入临床研究和市场，了解这些方法对制造的额外要求是很重要的。原则上，人们可能在扩增过程的早期转导或以其他方式改变MSC批次，以便只需要相对较少的细胞需要工程化。成功工程化的细胞随后将像往常一样扩增、配方和储存。虽然从遗传工程的角度来看这是有吸引力的，但并非所有方法都与遗传工程后的细胞增殖相容，因此可能失去所需的效果；在这种情况下，人们将限于在最终收获之前或之后对细胞进行遗传工程。例如，对于上述50升生物反应器的例子，产量大约是37×10^9个细胞，即使在高细胞滴度下，这个数量的细胞也可能有几升的体积。因此，转导如此大量的细胞需要相应的材料量——例如，适当质量的质粒以及大规模转染机制。通常选择化学转染途径，最近，已经开发出大规模工作的电穿孔设备。此外，大多数国家都规范了遗传改变生物的使用，用于创建重组质粒的细菌培养和由此产生的工程化细胞将被视为GMO，因此这样的工作将需要相应的批准以及适当的设施、培训和紧急情况下的去污程序；例如，德国认为现场通过物理手段灭活GMO污染材料，即高压灭菌是规则。因此，这些需求应该事先澄清——改装合适的设备可能是昂贵和耗时的。

3.5.2.化学工程化MSC

如上所述，增强MSC超越其自然状态是诱人的，另一种方法可能被称为化学工程——用化学化合物处理MSC以提高其治疗效果。例如，MSC已经被一种小分子化合物处理，表现出显著改善的治疗效果，使恢复接近正常水平。MSC被培养扩增，并且在收获前，在化合物存在的情况下共培养。然后收获并洗涤细胞，以便在应用MSC之前降低化合物的浓度。建议这种处理增强了MSC的存活并最小化了坏死事件（Cvdb，个人通讯）。同时，额外的处理过程很简单，重要的是，这一程序已经受到当局的监管审查，出现了一个简单的监管路径，因此这种技术的临床使用似乎是一个现实的选择。

因此，看来通过遗传或化学工程化MSC已经是现实，许多新方法正在被测试，其中一部分可能会进入诊所。其中一些额外的制造步骤似乎是直接的，而其他可能涉及大量投资和先进的计划。

3.6.冻存

为了让MSC进行冻存，细胞可以悬浮在合适的冷冻介质中，通常包含复杂的碳水化合物以及冷冻保护剂，经常使用的是5%的DMSO。后者通过控制冰晶形成来保护细胞免受冻结损伤；然而，它也是细胞毒性的，因此需要适当处理：需要控制的参数包括(a)尽可能让细胞以单细胞悬浮液的形式存在，以便DMSO能够接触到所有细胞，(b)细胞的最高滴度，以便有足够的DMSO可用，(c)在冷冻前DMSO中的停留时间限制，包括填充冷冻管的时间，(d)在DMSO中和冷冻前的冷储存。冷冻应该是一个受控的过程，虽然研究实验室有时使用简单的程序，如将细胞管储存在-80°C深冻冰箱的保温容器中，或者使用含有冷异丙醇的简单装置来减缓冷却，但在治疗环境中最常用的是受控速率冷冻设备；含有细胞的封闭管被放置在冷冻室的架子上，通过控制液氮的流入来控制温度。这些设备允许严格控制冷冻过程，控制冷冻曲线的陡度，以及进行补偿，例如，缓冲当样本穿过大约-130°C的玻璃温度时释放的热量。

通过生物反应器过程制造的MSC的冻存与平面/静态培养的描述相同，即通过细胞收获、细胞洗涤和在冷冻介质中配制。我们已经讨论了常见的冷冻保护剂DMSO的毒性，导致在冷冻前暴露时间有限。使用生物反应器制造MSC通常会产生更大的批次，因此冻存需要周密的计划和物流，因为一旦细胞被冷冻，就需要进入冷冻储存，而不能在转移过程中有任何中间的温度升高或解冻。

例如，一个50升的生物反应器运行，在微载体上扩增MSC，总共有35升的培养基，产生了大约37×10^9个细胞，即大约185剂，每剂200×10^6个细胞。假设30%的产品被各种IPC和QC测试消耗，这留下了129剂需要在受控条件下冷冻，并转移到冷冻储存中，同时避免在转移过程中任何显著的升温。这样做的挑战可能很大，需要适当的组织和设备。

4.血液细胞衍生疗法

以前，细胞治疗指的是将未经修改的细胞应用于特定的适应症，基因治疗指的是纠正患者的遗传倾向。近年来，这两个领域之间的区别已经模糊，因为治疗细胞成功地在体外进行了遗传工程改造，然后返回给捐赠者/接受者，这种方法也在本章前面讨论了MSC。

4.1.该领域的进展

自从嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）概念诞生以来的大约20年里，细胞处理取得了迅速和令人印象深刻的进展，目前（2023年1月）已经有5个FDA批准的产品，EMA也批准了类似的数量。在使用CAR的血液学/肿瘤学适应症中取得了进展，尽管制造过程仍然是繁琐、昂贵和不一致的。实体瘤仍然是难以捉摸的目标，对CAR-T单独治疗有抵抗力。对免疫抑制性肿瘤微环境的理解正在推动更先进的治疗，例如装甲策略，以及针对真正驱动突变的Neo-抗原TCR发现。下面我们讨论当前的、先进的和预期的未来的发展，并将其称为第一阶段、第二阶段和第三阶段。

4.1.1.第一阶段：Kymriah到Tecarta

最初，T细胞培养是使用开放式操作进行的，需要高度熟练的操作员进行劳动密集型的单元操作。T细胞传统上在2D塑料容器中培养，例如T-flasks，这些容器主要用于在湿热CO2孵化器中的贴壁培养，并在生物安全柜（BSC）中操作。GE和Sartorius Wave Bioreactors（现在的Xuri Cell Expansion System（Cytiva））允许T细胞在封闭系统中大规模扩增，具有取样和喂养口。使用的培养基（通常是RPMI或类似物）含有高达10%的FBS，以及高剂量的IL-2。细胞来源于手工Ficoll分离的外周血单个核细胞（PBMCs）。无血清定义培养基的出现，如X-VIVO（Lonza）和TexMACS（Miltenyi），使得扩增无需血清，尽管人AB血清仍然经常使用，但并没有明显的好处。使用Elutra（Terumo）设备，即逆流离心洗脱，可以比PBMC使用更定义明确的细胞群来启动培养。Miltenyi磁性微珠和CliniMACS分离/培养系统的出现，允许GMP合规的高度定义细胞类型（CD34+, CD19+, CD3/4/8+）的分离。Life Tech/Invitrogen（TF）的Dynabeads通过刺激目标细胞上的CD3/CD28受体大大推进了细胞的扩增。这种方法优于当时的标准——可溶性CD3（OKT3）。Carl June和宾夕法尼亚大学的其他人开创了基因修改以产生CAR-T，例如，基因修改是在体外使用低滴度病毒载体进行的，无论是慢病毒还是逆转录病毒。通过离心和沉淀然后手动填充来收获和配方基于细胞的药物产品通常是通过的。偶尔，COBE 2991（Terumo）被用来浓缩和配方收获。释放测试是缓慢和繁琐的，或者有时不存在。效力和其他质量属性的定义是与从鼠类向临床产品的过渡同时发展的。Terumo的TSCD焊接机的无菌焊接和密封大大推进了操作的速度和便利性，允许在BSC外进行几个操作。使用CryoMed（TF）的受控速率冷冻是重要的最后一步。这些技术在商业细胞疗法的第一阶段得到实施，允许诺华和Kite Pharma在2017年获得最初的BLA批准，并将疗法从学术环境转移到商业环境。

4.1.2.第二阶段：Autolus到Allogene

虽然T细胞疗法的技术格局在第一阶段已经建立，但在扩展规模和关键质量属性规范方面存在瓶颈，需要技术进一步进步。在2000年代开始出现几项进步，设计空间、质量由设计（QbD）和过程分析技术（PAT）的概念开始适应不太可预测的T细胞。Saint Gobain和Baxter的透气袋，以及Wilson Wolf的GREX，引入了从容器底部的半封闭透气膜，允许静态培养，大幅度扩增T细胞数量。Miltenyi Prodigy是CliniMACS PLUS的扩展，允许相同的分离程序，但结合了培养室和洗涤和收获、程序化转导和细胞因子喂养，以及GMP合规的定制用户程序。这种端到端封闭处理场景使得在临床中，即非分类设置中，从血液成分分离到冷冻药物产品的制造成为可能。在大多数开发实验室和合同制造商设置中，仍然需要无菌操作，例如生长因子/培养基饲料和载体准备，这需要继续依赖BSC。虽然Prodigy可能是一个完整的系统，但许多产品也继续使用Sepax或更新的Sefia处理系统（Cytiva）来收获细胞，减少液体体积，并在血液成分起始材料和最终药物产品上配方。与单一来源技术合作确实可以简化和整合技术操作，但它也有局限性。承诺单一单元平台使使用替代技术的流程改进更具挑战性。虽然像Miltenyi这样的公司经常更新平台，增加诸如袋装填充机或电穿孔仪之类的东西，但这些附加组件可能不如其他类似的竞争技术高效。此外，增加单元的操作占用设备的时间更长，并且在单元仍然专门用于单个患者时，阻碍了制造套件转换到下一个患者的进程。其他封闭系统继续提高成功率和影响，如Cocoon（Lonza）和Xuri。Cytiva系统包括Chronicle和Unicorn软件系统，因此在制造期间允许完整的制造执行系统（MES）软件包。Sepax和Sefia是Cytiva基于内部圆柱形处理设备的技术和操作进步，该设备具有固定大小的孔，允许将RBC和血小板与治疗性细胞类型分离，这些单元可以以封闭的、程序化的方式减少体积。选择Sepax或Sefia主要取决于正在处理的过程体积和细胞数量，Sefia更适合处理更大的细胞数量。使用这些设备简化了血液成分起始材料（APH）的冷冻；虽然不是必需的，但它是添加冷冻保护剂/DMSO配方的更受控的补充。冷冻APH有几个含义：冷冻-解冻通常减少了粒细胞的数量，而对T细胞活性的影响很小。冷冻APH最重要的方面是允许可预测的、计划的制造开始日和时间，这对于流程物流和操作成功至关重要。其他越来越多使用的体积减少技术包括LOVO（Fresenius）和GatherX（Wilson-Wolf）。LOVO是一种收获和洗涤设备，使用旋转的多孔圆柱来保留细胞并推出培养基。它是封闭系统的一部分，体积减少能力可降至约150毫升。

现在市面上有多种设备可以自动化、封闭且精确地填充冷冻袋。Finia（泰尔茂）可能是其中最知名的，它可以在温度控制的环境中填充标准或定制体积的冷冻袋，总共4个。Signata™ CT-5（Sexton Biotechnologies）是类似的设备，包括用于QC测试的较小袋的袋式歧管。这两种设备都可以为冷冻去气泡。Rotea和Sepax也有可能执行此操作，但需要定制应用。Miltenyi Prodigy即将发布一个模块，也可以在洗涤后填充袋子，使其成为一个完整的端到端设备。其他新的分离和洗涤技术也出现在这一领域，包括Rotea（TF），这是一个缩小版和简化版的逆流离心系统，使用流化床收获T细胞，对细胞更为温和。Gibco CTS DynaCellect磁性分离系统，包括Miltenyi微珠的替代品，基于DynaBeads CD3/28微珠，并包括去磁珠器。Aptamers是一种基于亲和性的核酸系统，尚未被充分利用。培养基。无血清培养基已成为细胞治疗行业的标准，现在扩展到许多高质量的产品，如CTS、X-VIVO、TexMACS。这些培养基无动物成分且高度定义。CryoStor™（BioLife Solutions）是一种常用的含DMSO的缓冲配方，已成功用于多种细胞类型的冷冻保存。

基因修饰

慢病毒和逆转录病毒载体仍然是将基因引入T细胞的最常用方法，尤其是CAR或TCR转基因。AAV也被广泛使用，但更多用于直接的基因治疗，如Spark、UniCure或Regenxbio。慢病毒载体可以编码高达9 kb的CAR或TCR有效载荷，但为了获得良好的产量，实际上是5-6 kb。慢病毒和逆转录病毒载体还可以容纳双顺反子传递，用于标签如Autolus RQR8，可用于排序、染色或作为安全开关；或“背包”或装甲策略，以克服免疫抑制性肿瘤微环境，例如表达细胞因子受体，如TGFβ受体显性负性或释放细胞因子；这些策略被称为装甲CAR。这些药物物质的生产和测试自第一阶段以来已经取得了相当大的进步，Oxford Biomedica和Yposkesi等公司处于进步的前沿。200升单次使用生物反应器（SUBs）的悬浮培养很常见，使用深度过滤器、TFF和离子交换色谱法获得高滴度收获，然后进行无菌过滤。专用生产细胞系可以对制造的一致性产生重大积极影响。例如，一个（HEK 293）线可以被设计为包含p93 gag/helper基因和VSVg假型基因，以便只需要转染转基因质粒。VSVg可能有一定的毒性，因此通常在诱导性启动子下使用，直到转染前才表达。复制能力慢病毒（RCL）测试仍然是一个主要瓶颈，减缓了产品线的快速创新迭代。载体的RCL测试周转时间约为8周，由于细胞系的繁琐传代。这些测试所需的上清/生产结束细胞的实际体积通常是相当大的监管辩论的主题。与FDA等监管机构的持续对话是必要的，以保持治疗进步，因为在当前的载体生产场景中从未有过重组的单一记录案例；事实上，FDA可能在演示10个或更多可接受的批次后放弃这一要求。新的第四代慢病毒系统将增加压力，以减少和简化RCL测试。此外，在慢病毒转导后没有观察到转化事件，这引发了对载体拷贝数（建议每转基因+细胞<5）和感染性（MOI）在制造步骤中使用的过于谨慎的限制的质疑。由于这些原因，并且为了继续解决未来的未满足需求，以及能够广泛提供细胞治疗，需要不需要RCl测试的新基因修饰方法。

电穿孔

非病毒方法为慢病毒转导提供了有吸引力的替代方案。CRISPR、转座子和mRNA都是遗传工程的可行有效载荷选项，并且已经使用电穿孔引入细胞。电穿孔平台各不相同，但似乎表现相似。MaxCyte Expert™系统、Lonza 4D™、Thermo-Fisher Xenon™以及Kytopen等新方法都被广泛使用。可以使用简单的质粒DNA，但通常对T细胞有毒，并且活性损失禁止广泛使用。然而，转座子可以非常高效，并且可以永久插入，类似于慢病毒载体。此外，转座子系统的载荷限制，如Sleeping Beauty™（Lonza）、LeapIN™（Atum）或TcBuster™（BioTechne）要高得多，没有已知的上限。较大的质粒大小仍然会降低活性，但细胞可以培养恢复。较小的迷你基因和迷你圈DNA可以在一定程度上减轻毒性；迷你圈DNA是由Plasmid Factory（德国Biefeld）销售的圆形DNA格式，由Nature Technology Corporation（Aldevron）许可。另一个系统，“狗骨头”（Touchlight）特点是双链线性DNA格式，在无细胞系统中生成，并且可以容纳高达20 kb的有效载荷。在临床中追求转座子的知名公司包括Catamaran、Precigen和Poseida等。CRISPR

基于CRISPR的方法是通过同源依赖重组（HDR）敲除基因的高效工具，这是一种消除单等位基因杂合疾病表现的有效技术。它在插入基因方面的使用已经变得更加普遍，ssDNA伴随（通过AAV载体）gRNA和Cas9在断裂点插入新基因。效率通常低于慢病毒载体，但也可以在选择制造过程的终点。这在将CAR或T细胞受体（TCR）插入自然TCR alpha位点时很有用，生理调节表达，并消除内源性TCR（eTCR）。在异体环境中去除e-TCR是必要的，但在自体或半匹配情况下则不那么重要。虽然认为敲除eTCR可以通过消除与CD3复合体的竞争来实现转基因TCR的更高表达水平，但目前尚不清楚这是否完全必要。此外，CRISPR试剂的许可和生产成本相当高，必须在预期或潜在报销的背景下考虑。

mRNA

利用mRNA生成CAR是一个相对较新的概念，随着mRNA COVID-19疫苗的巨大成功，这一概念引起了更多的兴趣。使用mRNA进行基因修饰在速度和生产成本方面有明显的优势。由于安全性问题较少，释放测试更加有限，其中最重要的是不需要进行RCL测试，正如宾夕法尼亚大学的一个早期例子所证明的。该产品使用了从血液成分分离中收获的PBMC的一日制造过程，经过电穿孔处理后冷冻。然而，释放测试仍然需要另外2周时间来完成。这些疗法本质上是短暂的。由于外源性mRNA的细胞内稳定性有限，体内CAR表达没有超过2周，这与可以永久性的慢病毒CAR疗法形成了鲜明对比。然而，如果随时间多次输注，可能引发免疫级联反应，使休眠和无反应的免疫系统重新激活，变得自我维持。看来这种方法的成本和速度优势可能会抵消当前的不确定性。

4.1.3.第三阶段：制造技术的未来方向

未满足的需求和持续的操作和成本限制继续推动技术的进一步发展。虽然CAR-T产品的响应率令人印象深刻，但复发率也相当高，可能是由于抗原的丧失或分化效应T细胞在经历慢性抗原暴露后细胞耗竭所致。减轻分化和耗竭的一种常见方法是使用较低剂量的IL-2（10-20 IU/mL），并包括IL-7、-15或-21，这些都是常见的γ链家族细胞因子，有助于维持干细胞记忆表型。作为关键原材料添加GMP生长因子会增加商品成本和供应链风险，但如果治疗对临床持久性有深远影响，这可能会被抵消。对于现有的治疗，该领域的当前方向是朝着更短的制造过程发展。诺华T-charge、Gracell Fast-CAR和BMS Nex-T平台都使用非常短的制造时间，细胞扩增有限。简单来说，这些T细胞被收获、基因修饰和冷冻保存。虽然这一趋势与原始第二阶段制造范式有些相反，但这些药物产品的效力似乎比传统培养的T细胞高得多（10-50倍）。这可能是因为细胞保持在中央记忆或干细胞记忆状态，因此更有可能在体内长期存在，而不会最终分化，同时保持持久的反应。快速制造的操作优势也是可观的。更短的过程意味着每个产品制造所需的洁净室时间和轮班工作更少。因此，在给定的制造区域内，可以在给定时间内生产更多的患者产品。快速流程大大减少了每批产品所需的培养基、细胞因子和劳动力，从而降低了COGS。最后，使用封闭设备允许将生产转移到C级洁净室环境中，从而进一步降低COGS。到目前为止，这些快速平台的临床反应一直令人鼓舞（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT04231747）。

更快地生产产品是必要的，但不足以更快地将产品送到患者手中，快速释放也是必需的。为此，Bac-T系统（BioMerieux）是美国药典USP72的一次进步，但仍然需要9-10天。Millipore MilliFlex系统是基于膜的，通常最适合mAbs，但温和的裂解溶液可能会将这种3天方法适应于细胞治疗。最终，针对细菌核糖体DNA序列的1天PCR方法将实现与快速制造相对应的释放速度。其他快速测试技术包括Accelix，它可以在洁净室中使用预装的试剂盒（标准或定制）进行实时流式细胞术结果，并可用于洁净室。除了快速释放外，还需要快速QA审查和处理。使用电子批次记录（EBR）可能是减少批次记录技术审查的关键，特别是关于GDP错误。偏差、RCA和CAPA仍然需要一个敏捷的QA部门来管理风险并允许患者接受产品输注。

Chain of Custody历来是通过纸质文件管理的。Trakcel等系统可以简化COC并为高通量商业化做准备。纸质系统仍然可以适用于产品数量较少的小规模第一阶段临床试验。进入商业阶段可能与产品数量大幅增加有关，在这种情况下，混合或错误的风险增加。COC软件可以帮助最小化这些风险。物流和运输也是供应链的关键组成部分。EVO™和CREDO™控制运输单元似乎非常适合血液产品。Cryoport拥有用于最终药物产品的LN2干运船，这些现在具有实时温度和位置跟踪，比以往发现的冷冻库只有在产品到达时才知道的情况有很大的优势。随着该领域的扩大，越来越多的创新思维和资金推动界限并扩大选择，自动化封闭处理技术继续增加。AdvaBio包括内置的在线代谢物和营养物质分析仪。微型化和新技术包括FloDesign Sonics（Millipore）、微流体系统（MicrofluidX）、ErbiBio（Millipore）。细胞封装是一项即将到来的技术，Celvivo；丹麦和TreeFrog Therapeutics，法国等公司正在使用这些方法。使用BioBlu（Eppendorf）或Ambr250（Sartorius）进行的非斜面搅拌罐中初级T细胞扩增高达10L，正在取得令人鼓舞的结果，这可能更接近已建立的PAT概念[59]。

尖端技术总结列在表15.2中。

5.诱导多能干细胞

它们与胚胎干细胞类似，被用作治疗性细胞的多能前体。因此，iPSCs本身并不是治疗方法，而是生产细胞治疗产品的中介。一旦生产出来，上述问题（遗传工程化的MSCs）在这里也适用：原则上，iPSCs可以在培养扩增之前或之后被诱导表现出所需的表型。这方面的限制也非常相似，通常需要在分化之前先对iPSCs进行扩增。因此，iPSC的制造过程包含了上述MSCs讨论的初始小规模培养和后续放大过程的元素。区别在于，首先，通过引入选定的转录因子从供体细胞中衍生出iPSCs。在这个步骤中，iPSC集落往往在几天内形成，如果使用悬浮供体细胞，可以通过形成贴壁集落很容易地区分。这些可以在小规模T瓶中扩增，如上文讨论的冷冻保存原则，进行表征和冷冻保存作为细胞库。当需要时，可以取出这个初始细胞库的样本，将它们扩增到更大的数量。类似于上述描述的过程，这些贴壁细胞可以利用讨论的工具在平面/静态培养中扩增；一个例外是由iPSCs的生物学特性引起的：与其他细胞在重新播种前从粘附表面释放并形成单细胞悬浮液不同，iPSCs不太能忍受缺乏细胞间接触，因此倾向于作为聚集体而不是单细胞悬浮液进行分割。较新的协议模仿生物生产和MSCs以前采取的路径，在生物反应器中培养扩增iPSCs，例如作为悬浮聚集体或微胶囊化。培养扩增iPSCs的关键是使用符合制药要求的培养基，特别是需要使用完全表征的培养基，即不含复杂动物来源成分的培养基。在这里也取得了巨大的进步，最初的商业产品如Stemcell Technologies的mTeSR培养基是基于含有牛白蛋白和人类蛋白质的配方，随后是一个简化的E8培养基含有人类蛋白质和B8含有重组人类蛋白质，因此，可能被称为化学定义培养基。扩增后，iPSCs可能会被操纵/分化，使它们表现出所需的治疗性细胞类型的表型。一旦iPSCs分化为所需的表型，这些细胞制备需要不含有未分化的iPSCs，因为这些可能会导致不受控制的生长。因此，最终产品中缺乏干细胞标记是来自iPSCs的细胞医药产品的一个重要规范。

6.基因治疗产品制造

6.1.介绍

基因治疗旨在通过遗传操作来纠正病理状态，例如通过提供有缺陷基因的正确版本，或诱导患者身体对病理情况产生期望的反应。这可以通过体外治疗患者的细胞来实现，如Yescarta（Kite Pharma）的各种疗法所述，参见第一阶段：Kymriah到Tecarta，或者通过将载体引入人体，影响许多或选定的细胞和组织，如Zolgensma（Novartis）。

6.2.短期和长期疗法

最近，mRNA技术因其在快速提供强大的COVID 19疫苗方面的成功而获得了极大的关注。它们通过将编码所需基因产物/蛋白质的mRNA传递到特定组织，例如肌肉，使这些组织中的细胞表达这种基因产物/组织。在Covid 19的情况下，这导致Covid 19刺突蛋白片段在细胞表面显示，这反过来又触发了期望的免疫反应。这种蛋白质片段的表达已被证明可以持续数天；虽然这通常足以触发免疫反应，但如果希望提供长期疗法，例如纠正遗传缺陷或长期提供治疗，可能不太有帮助。因此，为了诱导患者身体长时间产生某些蛋白质，已经使用了病毒工具将遗传有效载荷传递给人体细胞，这些包括单纯疱疹病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒以及逆转录病毒。考虑到这些平台在“诱导多能干细胞”部分提到的优缺点，腺相关病毒已经成为一个具有特别有利特性的工具。

6.3.腺相关病毒：生物学

AAV吸引人的特性之一是它们显然无害：据报道AAV的流行水平约为70%，并且报道的相关致病性有限。目前，已有3个产品获得FDA批准，而www.clinicaltrials.gov上有285个条目；因此，可以预期将有大量新的基于rAAV的产品进入市场。为了提供下文讨论的生产相关主题的背景，我们简要描述腺相关病毒（AAVs）的特征。AAV是非包膜病毒，属于细小病毒/依赖病毒家族/属。它们的衣壳由三种蛋白质组成，即VP1、VP2和VP3，分子量在60至90 kDa之间，总共约有60个单体，比例为1:1:10，尽管最近讨论了随机因素。根据衣壳蛋白的性质，目前已报道了8种血清型。AAV基因组包含一个大约4.7 kB的单链DNA分子，两侧有倒置末端重复序列（ITRs），后者作为病毒基因组复制和包装信号的起始位点。AAV基因组包含2个基因，编码9种蛋白质，使用替代翻译起始位点、替代剪接和替代开放阅读框。这组基因/蛋白质不足以复制，为了复制，AAV需要部分腺病毒复制机制——因此，腺相关病毒。空衣壳和满衣壳的分子量分别约为3670和4751 kDa；完整AAV的直径为26 nm。对于AAV基因组的表达，可以选择以环状质体形式存在或整合到宿主基因组的特定位置，例如在第19号染色体上；环状DNA在有丝分裂过程中倾向于丢失，因此，如果希望长时间表达感兴趣基因，环状路径更适合缓慢分裂的细胞。根据衣壳蛋白的性质，已描述了不同的血清型。这些似乎只表现出有限的组织特异性，以至于如果希望组织特异性，局部应用AAV似乎是直接途径；然而，结合介导组织特异性的结构的工程化衣壳蛋白可能会增强这一点。

6.4.腺相关病毒：基因治疗载体

要使用AAV作为基因治疗的载体，两种病毒基因都被总结性地删除，以为治疗性有效载荷腾出空间，并确保产生的重组病毒不能自我复制，从而最小化不受控制事件的风险。这导致一个重组病毒基因组，由感兴趣基因两侧的倒置末端重复序列组成；倒置末端重复序列的大小据报道为每个145个碱基，留下大部分约4.7 kb的基因组可用于有效载荷。由于重组AAV（rAAV）基因组缺乏AAV基因以及复制所需的腺病毒基因，这些必须在生产过程中提供。最初，这是通过使用腺病毒作为辅助病毒来实现的。然而，在生产系统中添加腺病毒增加了混合病毒收获的潜力。截至1997年，通过将所需的病毒复制周期基因分配到3个质粒中的方法被设计出来：（1）携带有效载荷的AAV载体质粒，（2）携带AAV rep和cap基因的AAV辅助质粒，以及（3）携带腺病毒衍生的AAV复制所需基因的腺病毒辅助质粒。为了促进rAAV的生产，然后将所有三个质粒共转染到生产细胞系中，如人类细胞系HEK293。最初，生产细胞系在平面/2D培养系统中培养，如细胞工厂或高尔基瓶/堆叠，这种配置中例如钙/DNA沉淀转染效果特别好。如在第一代MSC产品和制造过程部分讨论的，这些平台与细胞培养实验室中常见的设备（如CO2和温度控制孵化器）兼容，因此适合早期工作。然而，它们在支持放大能力方面有限，因此商业用途所需的大规模rAAV生产倾向于遵循第二代MSC产品和制造过程部分讨论的生物和细胞生产的道路：生物反应器，即倾向于进入一次性生物反应器。对于rAAVs，以及可能对许多其他基因治疗产品，使用成熟的一次性平台是一条直接的放大路径，并且可能进一步减轻对可能与其他类似产品交叉污染的担忧。如上所述，钙沉淀DNA转染特别适合平面系统。相反，它可能不适合悬浮系统，因此探索了替代的转染方法。大规模电穿孔是可能的，但当前仪器体积有限，因此，出于实用性考虑，现在经常使用化学转染剂。如上所述，经常转染三个质粒以提供rAAV的生产。用单个质粒转染可能以相当高的转染率发生。尝试用三个质粒转染可能会显著降低转染效率。这可以通过调整过程参数如细胞、质粒和转染试剂的浓度来部分抵消，或者可能被接受。绕过这个瓶颈的一种方法是生成已经表达rAAV复制所需机制的生产细胞系，以便这些细胞只需要用一个质粒转染，该质粒包含感兴趣基因，或者在Cevec/Cytiva市场销售的Elevecta系统中根本不需要转染。

6.5.下游处理

一旦产生了重组病毒颗粒，例如在上述一次性生物反应器系统中，它们就需要被纯化、配方、填充和包装。据报道AAV不能有效地从生产细胞中释放，因此第一步通常是通过洗涤剂或机械操作从生产细胞中释放rAAVs。得到的粗裂解物通常用酶处理以分解生产细胞来源的核酸，例如，苯那酶特别是广泛使用的。这种处理不仅通过破坏生产细胞系DNA提高了后续过滤步骤的效率，而且最小化了将不需要的核酸/基因作为污染物引入产品的风险。第二步，得到的rAAV悬浮液和剩余的细胞碎片通常经过深度过滤。

在第三步中，rAAV制剂会进一步纯化，例如通过一系列色谱步骤，如离子交换、使用与针对rAAV衣壳蛋白的抗体耦联的基质的亲和色谱，以及额外的离子交换或尺寸排除。这种纯化过程往往能产生高纯度的rAAVs。

生产过程据报道会产生完整和不完整衣壳的混合物，即带有和不带有DNA的衣壳，空衣壳的比例有时高达80%。空衣壳没有功能，因此它们的存在会降低产品的效力。因此，已经设计了去除空衣壳的方法，包括密度离心、流穿超速离心和专门的离子交换色谱；然而，虽然这些方法在小规模上被报道成功，它们在大规模操作中的实用性有时会受到质疑，可能会在病毒质量和数量之间做出权衡——以牺牲产品数量为代价获得高水平的完整和完好衣壳，或者存在大量的无载体（无效）衣壳。

最后一步通常是切向流过滤，用于将产品浓缩至所需的滴度，并将其悬浮在所需的缓冲溶液中。在这一步中，最终的散装药物物质可以冷冻保存，直到进一步加工。考虑到上述纯化步骤，据报道培养中产生的衣壳与最终药物物质中存在的衣壳产量比为30-60%。

然后进行配方、填充等步骤；这些步骤遵循既定流程。通常，散装药物物质被认为是低生物负荷的（而不是无菌的），一旦完成配方，散装药物产品可以通过无菌过滤来灭菌——如上所述，rAAV直径约为26纳米，大约是无菌过滤器孔径的十分之一，因此非常适合无菌过滤。

7.先进治疗药物产品特有的质量要求

7.1.欧盟

欧洲委员会在2017年11月发布了人们期待已久的Eudralex第四卷，关于先进治疗药物产品的生产质量管理规范指南，并在2018年5月实施。该指南涵盖了授权（那些拥有批准的市场应用）和研究性临床产品。包括的主题都是标准药品GMP中通常讨论的，其中一些情况下采用了更基于风险的方法（RBA）；该指南还提供了一些适用于ATMP的具体GMP示例。

一般原则与标准GMP没有区别，即ATMP制造商负责确保他们生产的产品的质量、安全性和效力。根据临床开发的阶段、生产复杂性和公司规模，允许使用更简单的药物质量体系。药物质量体系通常讨论，并包括GMP的基本要素：人员要求、适合使用的设施和设备、具有清晰规格和说明的文件系统、一致的制造过程、独立于制造的质量控制单元和系统，以及记录保持、变更控制、偏差、物料追溯和定期产品质量审查的系统。

指南中包括了针对基于风险的方法（RBA）的具体指导，它允许根据生产技术、生产设置和临床阶段具有一定的灵活性。RBA旨在允许ATMP的技术/生物学需求所需的灵活性；然而，它并不打算削弱GMP要求，因此，并不免除制造商在可能需要灵活性的地方进行彻底风险评估的义务，并需要包括理由以确保产品的安全性和质量。RBA可以应用于设施、设备、流程、物料、释放和稳定性测试。通常，RBA也用于产品需要在制造后不久“新鲜”地交付给患者/临床对象，而完整的释放测试可能尚不可用的情况。针对无菌测试的具体指导与美国FDA关于这一主题的指导一致，包括使用快速测试的可能性，在过程中早期进行无菌测试——在中间过程步骤中，以及与临床研究者建立协议以管理有关无菌测试结果的额外信息，包括在应用/输注后检测到的污染。洁净室、无菌操作、人员培训和卫生、服装以及无菌工艺模拟的要求原则上与附件I中描述的相同。关于无菌制造的特定部分提供了ATMP特定设备的房间分类要求的相关示例。然而，对开放操作、发酵罐/生物反应器和封闭系统的要求与任何无菌产品或生物制品的要求相同。关于多产品设施的指导和示例在帮助方面很有用，因为它提供了许多基于时间或空间隔离的产品批次分离的ATMP特定场景。文件和起始/原材料的部分提供了与ATMP相关的具体和有用的示例。关于防止产品、起始物料交叉污染的部分特别有用，包括针对自体产品的场景。过程验证、检测验证和清洁验证的部分描述了临床（一些灵活性）和商业ATMP产品的特定要求。

7.2.美国

FDA尚未针对ATMPs发布具体的GMP。FDA行业指南《第1阶段研究产品的良好生产规范》（2008年7月）为首次人体临床试验的最低GMP要求提供了一个框架。这个指南包括附件，描述了对多产品设施、外来因子控制、细胞和基因治疗产品以及无菌/无菌加工产品的期望。该指南特别提到了FDA行业指南：《无菌加工生产的无菌产品——现行良好生产规范》（2004年9月），因此对无菌加工的期望与商业产品的要求是相同的。超过第1阶段后，期望是完全的cGMP（21CFR第211部分）。请注意，对于所有临床生产阶段，监管机构通常会接受有理由的阶段性适当的验证水平。FDA行业指南：《人类基因治疗研究新药申请（IND）的化学、生产和控制（CMC）信息》（2020年1月）是全面的，提供了一些GMP期望，包括对外来因子、原材料评估、自体和异体细胞、细胞和病毒库、过程和检测验证、安全测试、无菌测试以及评估新鲜产品的无菌性和对输注后检测到的污染的反应的特定指导。在欧盟和美国释放临床和商业产品遵循相同的标准GMP，具有相同的期望。然而，值得注意的是，在欧盟，每个批次的认证必须由合格人员（QP）完成，根据Eudralex第四卷附件16，《合格人员的认证和批次释放》，定义了认证的要求。在美国，制造商任命独立的质量责任人员来释放批次。

8.结论

本章涉及细胞、基于细胞的以及病毒基因治疗，所有这些都自诞生以来加速发展，这反映在正在开发的治疗方法数量、临床试验数量和批准产品数量上。生产过程的复杂性也是如此。从最早的2D塑料使用，当前技术已经扩展到包括更复杂、半自动化、封闭的处理系统。每个新技术都从类似的设备和工具阶段开始，然后逐步发展到为先前技术开发的更复杂的方法，这是非常有趣的。这些进步使得所有讨论的治疗实体的生产更快、更稳健、更一致。更稳健和敏感的分析工具的开发为市场和监管机构提供了对这些治疗方法的更深入的生物学特征描述。这提供了更有效的方法来确定可比性和过程性能确认（PPQ）。尽管取得了这些进步，但仍需要进一步的发展，以民主化这些治疗方法，维持市场，并通过雄心勃勃的创新来满足未满足的需求。未来的发展方向可能包括治疗效果、产品处理和储存、使用载体的体内基因修饰、脂质纳米颗粒以及现场护理（POC）新鲜制造的进步。

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