靶向递送最新 | 双抗与LNP-mRNA先后给药实现mRNA的高效靶向递送

导读：mRNA 技术作为新一轮医药革命的引领者，除了应用于预防或者治疗性疫苗，还能广泛应用于多种人类疾病的治疗中，包括治疗癌症、自身免疫和遗传性疾病。mRNA 药物的功效主要取决于将足够剂量的mRNA 递送至特定细胞类型的能力。当前广泛使用的四组分LNP具有明显的肝脏倾向性，在肝外器官/组织/细胞靶向递送mRNA的应用方面存在局限性。

2024年10月20号，澳大利亚昆士兰大学生物工程与纳米技术研究所Seth W. Cheetham等人在bioRxiv上发表文章：Targeted mRNA delivery with bispecific antibodies that tether LNPs to cell-surface markers。他们使用双特异性抗体(BsAb)实现了mRNA-LNP 的靶向递送。BsAb 由两个连接的单链可变片段 （scFv） 组成，它们可以与 LNP 外部的PEG和靶细胞表面富集的蛋白质结合。BsAbs 的靶向性使 mRNA 药物递送到肝脏之外，有效地增加特定类型细胞中的 mRNA 的摄取和表达，并减少脱靶组织中的摄取。

mRNA-LNP 靶向递送可以通过两种方式将BsAb连接至LNP表面：第一种，称为预混合（Pre-mixing），即在注射给药之前将LNP与BsAb预先混合，得到抗体修饰的LNP；第二种，称为预靶向(Pre-targeting），细胞先后经BsAb和非修饰LNP处理。他们在体内外证实BsAbs 和 mRNA-LNPs 的先后给药明显优于使用抗体修饰的LNP。这一方法有望避免抗体偶联LNP(Ab-LNP)对mRNA成药特征的不利影响，简化其生产工艺和质控策略。

在体外储存和体内循环过程中，脂质纳米颗粒（LNP）为mRNA提供保护层，免遭降解，同时，还能使带负电荷的mRNA链实现跨膜递送。LNP 表面的聚乙二醇 （PEG） 涂层通过形成水合层，减少蛋白质相互作用，从而降低免疫识别，赋予LNP“隐身”特性。然而，静脉给药后，LNP 积累和 mRNA 表达主要发生在肝脏中。LNP的脂质组成促进肝脏摄取。并且，脂质纳米颗粒的粒径大学更容易通过肝脏的血管（肝窦内皮细胞上的跨膜纳米孔，它们允许血液成分在肝毛细血管和肝实质细胞之间进行交换，直径通常为100-150nm）开窗进入到肝实质细胞。此外，蛋白质吸附到 LNP 表面形成“蛋白冠”，特别是，血液中的载脂蛋白E（ApoE）可以被吸附到LNP表面，并通过与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDLR）相互作用，促进LNP的肝细胞摄取。总的来看，LNPs 的嗜肝性限制了 mRNA 治疗肝外疾病的潜力。

肝外组织局部给药不适合广泛应用，因为它具有侵入性，并且对分散的靶细胞（如免疫细胞、干细胞和肿瘤转移）具有挑战性。因此，全身给药是首选，但需要 mRNA-LNP 具有高效和细胞特异性的靶向递送。被动靶向通过提升血管通透性，减少病理组织周围的淋巴引流，以增强纳米颗粒的进入和驻留。通过聚乙二醇化延伸LNP 在循环系统中的持续时间，使纳米颗粒能够到达外周组织，但被动递送无法持续且效率低下。

为使 LNP主动靶向特定类型的细胞，当前研究主要聚焦在修饰 LNP 的脂质组成或通过靶向基团（包括配体和抗体片段）使LNP表面功能化。脂质偶联物使LNP 的生产复杂化，阻碍了放大生产和临床转化。在 LNP 生产过程中掺入修饰物会导致靶向配体的封装，从而降低纳米颗粒表面靶标结合位点的可利用率。虽然存在错误方向的附着，但是，LNP合成后的功能化可以增加靶向结合部分的可利用率。这些 LNP 的修饰可以增强靶标位置的积累和受体介导的内化，然而，它们会改变 LNP 电荷，增加纳米颗粒尺寸，并改变蛋白质吸附谱，导致纳米载体的生物分布、摄取和免疫原性发生改变。

为了确定细胞表面抗原特异性 BsAb 是否能够实现靶向 mRNA-LNP 递送，研究者采用LNP包封编码绿色荧光蛋白的eGFP mRNA。

由于主动靶向通常是通过将靶向基团连接到 LNP（预混合）而不是目标细胞（预靶向）来实现的，因此研究者首先表征了表面功能化对 LNP 特性的影响。eGFP mRNA-LNPs 与 anti-PSMA（叶酸水解酶1）或者anti-EGFP（表皮生长因子受体）双特异性抗体的预混合分别将eGFP mRNA LNP粒径从 82 nm 增加到 181 nm 或者412 nm。BsAb 涂层改变了 LNP 形态，降低了颗粒均匀性，并且诱导了纳米颗粒聚集，这些都会改变体内LNP的行为特征。对于静脉注射和组织穿透性来说，粒径低于150nm的脂质纳米颗粒是优选。

MDA-MB-468 乳腺癌细胞表面表达EGFR，但不表达PSMA，而 LNCaP 前列腺癌细胞同时表达EGFR 和 PSMA。eGFP mRNA LNP与 anti-PEG+anti- EGFR双特异性抗体的预混合显著增强mRNA-LNP 向 MDA-MB-468 的递送，相反，与anti-PEG+anti- PSMA双特异性抗体的预混合并未改善mRNA-LNP 向 PSMA 阴性细胞系的递送。有意思的是，与anti-PEG+anti- PSMA双特异性抗体的预混合会显著提升mRNA-LNP 向 LNCaP 前列腺癌细胞的递送，而与未修饰的非靶向性LNP相比，anti-PEG+anti- EGFR双特异性抗体的预混合并不会改变mRNA-LNP 向 LNCaP 前列腺癌细胞的递送效率。

与预混合相比，利用anti-PEG+anti- EGFR双特异性抗体采用预靶向方法将会使得eGFP mRNA LNP表达水平获得显著提升。类似的，与预混合相比，PSMA双特异性抗体对LNCaP 前列腺癌细胞的递送效率提升了3倍，而EGFR双特异性抗体对LNCaP 前列腺癌细胞的递送效率提升了4倍。与非靶向 LNP 转染相比，eGFP mRNA LNP与EGFR-PEG 和 PSMA-PEG 的预靶向分别将eGFP 表达水平增强4 倍和 5 倍。值得注意的是，EGFR-PEG 双特异性抗体的预靶向增强了 mRNA-LNP 向 LNCaP 前列腺癌细胞的递送，而预混合并没有提高摄取。

在BALB/c 裸鼠中皮下注射MDA-MB-468 细胞，建立乳腺癌荷瘤小鼠模型。然后，采用EGFR双特异性抗体的预混合或预靶向策略验证Fluc mRNA-LNP在小鼠体内的靶向性。在注射8h后，与非靶向 LNP 相比，EGFR双特异性抗体的预混合或预靶向使得Fluc mRNA-LNP向肿瘤组织的递送效率分别增加了超过8 倍和 7 倍以上，同时使得肝脏中的荧光素酶表达信号分别减少了三分之一和一半。

在注射48 小时后，所有小鼠肝脏中的荧光素酶表达均发生降低。相比之下，在双特异性抗体预靶向组小鼠中，肿瘤组织中的荧光素酶表达与注射后8h的时间点一致，仅降低了约 10%。然而，在双特异性抗体预混合组小鼠中，与注射后8h相比，肿瘤组织中的荧光素酶表达水平下降了 60%。

肿瘤信号的离体分析证实了LNP体内的生物分布结果。与非靶向 mRNA-LNP 给药相比，预混合和预靶向组的离体肿瘤组织中的荧光信号分别高出 4.6 倍和 3.5 倍以上。与此一致的是，非靶向 LNP 组肝脏中的荧光总通量是最高的。与预混合组相比，预靶向组肝脏中的荧光通量也是显著降低的。类似的，预靶向组脾脏中的荧光通量是最低的，而非靶向LNP组和预混合组肝脏的荧光通量分别是预靶向组的5倍和8倍。预混合组较高的LNP肝脏摄取率可能是由于LNP与双特异性抗体混合后引发的理化特异改变引起的，包括LNP周围形成的较大蛋白冠，表面电荷由正电性转变为负电性等。预靶向组小鼠血液、心脏及肾脏中的荧光通量均非常低。

这项研究证实，利用靶向细胞表面标记物和LNP表面PEG的双特异性抗体可在细胞水平和小鼠体内实现高效的靶向递送。预靶向递送策略在时间上将双特异性抗体和LNP的注射分离开来，实现mRNA的高效摄取和表达。相比于双特异性抗体与LNP的预混合策略，预靶向能够显著降低LNP表面的蛋白冠。在非靶器官（如肝脏和脾脏）中较低的 mRNA 含量和摄取可降低 mRNA 疗法的毒性。虽然 mRNA-LNP 从代谢活跃的肝脏中会被清除，但高效的mRNA 表达仅在肿瘤中持续存在。双特异性抗体可将 mRNA 递送至以前无法接近的组织，从而扩大了 mRNA 疗法可治疗的疾病范围。

这项研究首次验证了mRNA-LNP的预靶向递送策略，与功能化的 mRNA-LNP 相比，mRNA-LNP 和靶向剂 (BsAb) 的单独生产和给药大大简化了制造和质控过程。mRNA-LNP和双特异性抗体的临床应用和安全性，为预靶向性递送技术的临床转化提供了强有力的基础。

[1] Bettina Dietmair, James Humphries, Tim R Mercer, Kris J Thurecht, Chris B Howard, Seth W Cheetham. Targeted mRNA delivery with bispecific antibodies that tether LNPs to cell-surface markers. bioRxiv 2024.10.17.618962; doi: https://doi.org/10.1101/2024.10.17.618962.

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