基因治疗的制造之道：生物技术的新突破

摘要：将遗传物质转移到宿主患者体内以获得治疗益处的概念已经有超过半个世纪的历史。然而，直到2017年，随着美国FDA批准首个CAR-T细胞疗法，随后欧盟也批准了这一疗法，这一概念才成为临床现实。自首个产品获批以来，已有更多基因疗法上市，而且处于晚期临床试验阶段的产品数量表明，基因疗法可能成为生物制药行业增长最快的领域之一。对于任何生物制药产品的商业成功来说，能够经济地大规模生产治疗产品以满足市场需求是一个关键因素。迄今为止，制造过程已经能够在必要的规模上生产满足临床研究需求的基因治疗病毒载体。然而，为了满足商业需求，尤其是对于治疗患者群体庞大的疾病的疗法，当前的生物制造过程需要扩大规模和优化。

1.介绍

基因转移至宿主细胞以替代缺失或有缺陷的基因，并且转移的基因表达能够提供治疗益处的概念最早由西奥多·弗里德曼（Theodore Friedmann）提出，第一个临床实验是在1970年进行的。基因治疗最初被设想为一种治疗遗传病的方法。然而，也构想了替代策略来治疗其他具有遗传成分的疾病。当前的基因治疗模型包括：（i）基因替代，传递一个功能性基因以替代一个不起作用的基因；（ii）基因沉默，使一个对细胞有毒的突变基因失活；（iii）基因添加，过度表达一个“外来”或外源基因以影响细胞功能；以及（iv）基因编辑，对患者基因组中的基因进行永久性操作。

在过去50年中，基因治疗经历了过山车般的发展，许多进步之后伴随着挫折。1980年，随着重组DNA的出现，科学家们证明了可以在体外用rDNA转化小鼠骨髓细胞，并将转化后的细胞注射到经过辐射的小鼠体内，产生主导的骨髓群体。同样的技术也被用来转化两名患有遗传性疾病β-地中海贫血患者的骨髓细胞，使用重组人类β-珠蛋白基因。第一个涉及人类患者的试验使用了逆转录病毒介导的腺苷脱氨酶（ADA）基因转移到两名患有严重联合免疫缺陷（SCID）的儿童的T细胞中。总体而言，结果是肯定的，并提供了概念验证，即基因治疗对某些患者是一种安全有效的治疗方法。然而，1999年杰西·格尔辛格（Jesse Gelsinger），一名18岁患有较轻微的氮代谢障碍鸟氨酸转氨甲酰酶（OT）缺乏症的青年，在参加基因治疗试验时因腺病毒载体相关毒性死亡，这表明了与基因转移相关的科学复杂性。在五名患有严重联合免疫缺陷-X1（SCID-X1）的患者体外转染CD34+细胞后发展成白血病，其中一人死亡，进一步引发了担忧，这些细胞被转染了编码γ链细胞因子受体亚单位的小鼠逆转录病毒载体。这项研究包括了20名患者，基因治疗确实为两名患者提供了完全的疾病表型纠正。中国的监管机构在2003年批准了世界上第一个商业化的基因治疗产品Gendicine，用于治疗头颈鳞状细胞癌，这是一种皮肤癌。Gendicine是一种经过工程改造的病毒，携带有制造抗肿瘤蛋白的基因指令。这种产品在中国以外没有获得批准，直到2012年欧洲才批准了第一个基因治疗产品Glybera。Glybera利用一种重组腺相关病毒（AAV），可用于治疗家族性脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD）。然而，由于LPLD是一种罕见疾病，患者数量极少，这种药物无利可图。因此，制造商拒绝更新市场授权，Glybera在2017年退出市场。2017年8月30日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了tisagenlecleucel（Kymriah），这是第一个获得FDA批准的基因治疗产品。Kymriah是一种针对CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞免疫疗法，用于治疗年龄≤25岁的B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者，这些患者对治疗有抗性，处于第二次或更晚的复发状态。Kymriah随后在2018年获得欧盟批准。表14.1提供了截至2022年12月FDA批准的所有基因治疗产品的列表。

转染宿主细胞的三种通用协议（如图14.1所示）：体外、体内和原位。在体外基因转移中，患者的细胞被分离并用治疗基因转染。转染的细胞在被重新输回患者之前进行扩增。这种方法已有效地用于儿童白血病的CAR-T细胞治疗。虽然体外基因治疗对治疗血液疾病有效，但体内基因治疗对治疗脑部、脊髓或肝脏疾病更有效。体内基因治疗直接将基因载体注入宿主，通过循环血液或脑脊液，在全身范围内转染目标细胞。主要使用两种类型的病毒载体：腺病毒（AdV）载体和腺相关病毒（AAV）载体。与体内基因治疗类似，原位基因治疗直接向宿主患者引入载体；然而，主要区别在于载体是被施用于患者的特定器官或区域，而不是静脉注射。

与体内基因治疗相比，这种方法具有几个优点，比如减少潜在的副作用、降低载体剂量的需求，以及因此而降低的成本。任何基因治疗策略成功的关键在于拥有一个能够作为安全且高效基因传递工具的载体。治疗性基因可以通过病毒载体或非病毒载体传递给细胞。研究最多的非病毒载体是聚合物、脂质、无机颗粒或不同类型的组合。与病毒载体相比，非病毒载体在细胞毒性、免疫原性和致突变性方面较低。然而，非病毒载体并不具备理想的特性，并且面临诸如基因转移效率、特异性、基因表达持续时间和安全性等关键挑战。目前FDA批准的基因治疗中没有使用非病毒载体。相比之下，病毒具有复杂而精确的结构特征，通过自然进化调整，以高效转染特定的宿主细胞或组织。目前FDA批准的基因治疗中使用几种病毒作为基因传递载体，包括逆转录病毒（由小鼠白血病病毒（MLV）衍生的γ-逆转录病毒载体和主要来自HIV-1的慢病毒载体（LV））、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒1型。这些病毒载体的典型特征总结在表14.2中。病毒载体的主要限制是非优化过程的产量相对较低。要使病毒基因治疗在临床和商业上取得成功，必须有能够高效和经济地生产病毒的生物制造系统，以满足市场需求。

2.慢病毒

慢病毒是逆转录病毒科的一个亚科。与其他病毒相比，逆转录病毒具有独特的特点，它们包含单链RNA，在宿主细胞感染期间会被逆转录。与早期临床试验中作为潜在基因治疗载体被广泛研究的肿瘤病毒亚科不同，慢病毒亚科能够感染静止和后有丝分裂细胞，被归类为复杂逆转录病毒。逆转录病毒的衣壳是一个包膜蛋白壳，包含病毒基因组，直径为80-100纳米。围绕衣壳的包膜结构是一个脂质双层，包含病毒编码的表面糖蛋白和源自宿主细胞的跨膜糖蛋白。慢病毒亚科的基因组是线性的、非分段的、单链RNA，长度为7-12 kb。简单逆转录病毒的基因组，如γ-逆转录病毒，包含三个主要编码段和一个小型编码域。主要段包含三个基因——gag、pol和env——它们编码对病毒整合、复制和包装重要的蛋白。小型编码域包含pro基因，编码病毒蛋白酶。复杂逆转录病毒，如慢病毒，的基因组包含与简单逆转录病毒相同的基因（gag、pol和env），但还包含六个额外的基因——两个调节基因和四个辅助基因——它们编码对病毒复制、结合、感染和释放重要的蛋白。表14.3概述了这六个基因及其表达蛋白的功能。

逆转录病毒通过外层包膜上的糖蛋白与特定细胞受体之间的相互作用感染细胞。一旦病毒与细胞表面受体结合，就会发生一系列事件，导致病毒颗粒被纳入细胞脂质双层，随后病毒遗传物质被卸入细胞质。然而，慢病毒的生命周期中发生了一些独特的事件，这解释了它们能够感染非分裂细胞的能力。首先，基因表达发生在两个独立的阶段，即早期和晚期，这两个阶段由rev蛋白的结合分隔。其次，慢病毒通过vpr基因表达的蛋白感染非分裂细胞。最后，仅在复杂逆转录病毒中发现的tat基因对HIV-1的复制至关重要。

2.1.慢病毒载体在基因治疗中的应用

作为基因治疗载体研究最多的慢病毒（LV）是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。安全性至关重要，由于HIV-1对人类的致病性，LV载体系统被设计为复制缺陷型。几乎所有的临床和研究工作，包括用于生产CAR T细胞的慢病毒载体，都基于第三代包装系统和自失活（SIN）配置，自第三代慢病毒载体开发以来，最先进的慢病毒载体的设计并没有发生戏剧性的变化。第三代载体基于一个四质粒系统，包括一个基因转移载体（TV质粒）和三个辅助质粒，如图14.2所示。TV质粒是转移到目标细胞的唯一遗传物质，由包含转基因表达盒的LV骨干组成，其两侧是需要用于包装、逆转录和整合的顺式作用元素。所有辅助基因，nef、vpr、vpu和Vif，都被移除，因为它们是不必要的，调节tat基因被消除。复制所需的rev基因以转录方式提供，以创建一个条件包装平台。载体被赋予一个由非常特定的糖蛋白组成的包膜结构，即狂犬病病毒糖蛋白（VSV-G），这使得载体具有高亲和力，能够感染多种细胞类型。通过删除包含TATA盒和转录因子结合位点的3′-LTR的一部分，安全性得到进一步增强。因此，载体包装系统变得自失活（SIN）。

2.2.生产细胞系

大多数当前的LV载体生产系统涉及对HEK293或HEK293T细胞的瞬时转染。这些细胞被转染含有gag-pol、env、rev和TV质粒的四个质粒。与HEK293细胞系相比，HEK293T细胞系产生更高的病毒滴度，因此是首选的生产平台。HEK293细胞系和HEK293T细胞系之间的唯一区别是后者携带肿瘤病毒SV40大T抗原。表达SV40 T-抗原的细胞中引发细胞生长和转染效率增加的机制尚不清楚，但这一现象也在CV-1（SV40 T-抗原阴性）和COS-1（SV40 T-抗原阳性）细胞之间得到证实。然而，SV40 T-抗原是肿瘤病毒，因此带来了一些安全问题。使用四质粒转染方法在病毒滴度上的批次间变异性也是一个重大挑战。第一个成功的稳定生产细胞系之一是STAR包装细胞系。该细胞系是通过将HEK293T细胞与编码密码子优化的gag-pol基因的γ-逆转录病毒载体共转染，随后引入HIV-1调节蛋白Tat和Rev的基因、一个包膜蛋白和一个HIV-1 LV载体。优化转染载体基因组表达盒的结构，导致了SIN LV载体生产细胞系的开发。与瞬时转染相比，稳定生产细胞系具有几个优点，包括批次间的可重复性、可扩展性和成本。基于HIV-1的LV载体开发稳定生产细胞系已被证明是具有挑战性的。包装基因和与HIV-1基础LV载体发生的基因沉默在长期培养期间会导致细胞毒性。为克服这一限制，采用了两种不同的策略。第一种策略使用四环素诱导系统来控制VSV-G和gal-pol基因的表达。替代诱导型稳定细胞系的策略是创建组成型包装细胞系。这些已经为一些比VSV-G毒性小的包膜蛋白开发出来，如cocal和RD114-TR。

2.3.慢病毒载体生产

慢病毒载体在几种FDA批准的基因治疗中得到应用。如表14.1所示，这些治疗都采用体外基因转移，并且剂量要求高达10^9个CAR-T阳性细胞。根据FDA指南，CAR-T阳性细胞被视为最终治疗产品（在欧盟也称为药品），而LV载体被视为关键原材料。尽管最终的细胞产品是自体的，并且必须为每个患者单独生产，但LV载体可以大量生产，并在-80°C下冷冻保存数年。

慢病毒载体的商业规模生产可以通过扩展（即增加辅助生产系统）支持锚定依赖细胞的小规模系统，或者通过扩展支持悬浮细胞扩增的系统来实现。目前，大多数大规模生产依赖于锚定依赖细胞。由于HEK293细胞是弱锚定依赖的，滚筒瓶培养并不普遍。生产是在多托盘系统的平行培养中进行的——无论是细胞工厂还是细胞堆叠。首选系统是10堆叠系统。从理论上讲，可以使用40堆叠系统，但这些系统由于其大小和重量而存在处理问题。此外，堆叠之间的质量传递可能不均匀，这导致溶解氧水平的变化。LV载体收获次数可以从一次最终收获到最多三次收获，从12-24个10堆叠细胞工厂设备中生产出20-52升。使用细胞工厂生产LV载体有一些缺点，即收获窗口有限、劳动强度大、在开放式系统中保持无菌以及需要大量的孵化器空间。为此，研究人员已经研究了固定床系统、中空纤维生物反应器和装有Fibra-cel圆盘的Wave生物反应器，细胞被固定在圆盘上。表14.4比较了在LV载体生产中使用的不同的生产系统。

由于锚定依赖细胞在可扩展性上的固有限制，HEK-293 T培养物可以适应无血清、悬浮培养，用于慢病毒载体生产，并在传统的搅拌罐生物反应器中使用。无血清悬浮培养的主要缺点是细胞密度较低，与锚定依赖细胞培养系统相比，病毒滴度降低。使用悬浮培养的初始研究表明，病毒滴度在10^6 TU/mL及以下。通过在连续模式下而不是批量模式下运行生物反应器，LV载体的累积产量可以增加高达15倍，滴度达到3.2×10^7 TU/mL，与锚定依赖细胞培养系统相当。最近的研究通过在悬浮介质中逐渐适应，报告了10^8 TU/mL的LV载体滴度。在悬浮培养中培养细胞时，另一个考虑因素是从上清液中分离细胞和病毒。连续培养利用了声波细胞过滤技术和切向流深层过滤（TFDF），这些技术能够在生物反应器内保留细胞。累积功能产量达到3.3×10^11和3.9×10^11转导单位；前者在6天的LV生产中，使用了16.3升的灌注介质，后者在4天内使用了16升。批量培养依赖于收获后使用离心和过滤来去除细胞。

3.腺病毒

腺病毒（Ad）最初于1953年在人类脂肪组织中被鉴定出来。有六个物种（A-F）感染人类，进一步细分为五十多种感染性血清型。腺病毒衣壳的球形旋钮结构对coxsackie/腺病毒受体（CAR）具有高亲和力，该受体可在人体各种细胞中找到。因此，人类腺病毒被认为是所有急性呼吸道感染的5-10%的原因。腺病毒的传染性，以及它们利用细胞机制合成病毒mRNA和蛋白的能力，导致腺病毒载体在大约50%的当前临床试验中得到使用。

腺病毒是一种无包膜病毒。基因组是线性的、双链DNA（dsDNA），长度在26到40 kb之间[73]。这种线性形式在病毒衣壳内被组织成紧凑的类似核小体的结构，并且在每个DNA链的末端具有类似发夹的倒置末端重复（ITR）序列。ITRs的长度不同，可以在末端之间有30到371 bp。如图14.3所示，病毒基因组包含两个主要的转录区域，称为早期区域和晚期区域。基因组的早期区域包含四个重要的转录单元（E1, E2, E3和E4），这些单元在细胞感染后被激活。此外，基因组包含两个延迟早期转录单元（IX和IVa2）和一个主要的晚期（ML）转录单元，通过翻译后处理（从L1到L5）处理生成晚期区域mRNAs。

3.1.腺病毒载体在基因治疗中的应用

第一代腺病毒载体的基因组中E1A/E1B区域被多达4.5 kb的DNA转基因盒替换。E1A蛋白是病毒复制所必需的。从病毒基因组中删除这些基因，因此需要开发互补的生产细胞系，这些细胞系提供了这些基因，如293, 911, N52.E6或PER.C6。E3区域对病毒复制并非必需，也可以被删除以创造额外的空间用于转基因盒。这些消除允许向载体中插入多达8.3 kb的DNA。第一代腺病毒载体受到两个限制的困扰：（i）腺病毒蛋白的新表达可以激活宿主免疫反应，导致清除病毒感染的细胞；（ii）如果在腺病毒载体和生产细胞的工程E1区域之间发生自发重组，可以在基因扩增期间产生具有复制能力的腺病毒。

除了删除E1和E3基因外，第二代腺病毒载体还删除了E2和E4基因。删除这些额外的基因允许插入多达14 kb的DNA转基因盒。然而，E2和E4区域包含转录增加病毒编码基因表达的蛋白的基因。因此，与第一代腺病毒载体相比，第二代腺病毒载体中治疗基因的表达较低。与第一代载体一样，细胞毒性T细胞攻击并消除体内转导的第二代腺病毒载体的细胞，限制了治疗基因表达的持续时间。

第三代腺病毒载体，也称为剥离或无病毒载体，除了ITR和包装区域外，所有腺病毒DNA都被移除。这允许向载体中插入36 kb的DNA。复制需要包装细胞与辅助载体（HV）共感染，辅助载体能够在转录中产生所有必要的蛋白。剥离的腺病毒载体在表达HV和Cre重组酶的HEK293生产细胞中生产。HV蛋白允许剥离载体的复制和包装。工程化的Cre确保通过Cre介导的loxP位点重组，HV基因组包装信号被切除，并且只有剥离的腺病毒基因组可以被包装。

3.2.腺病毒载体生产

几个上游过程参数影响腺病毒载体生产的数量和质量。这些包括生产细胞系、病毒感染参数、细胞生长条件和操作模式。这些参数可以相互影响，需要一个全面的、系统级的方法来优化生物制造过程。

第一代腺病毒载体的生产通常使用HEK293和PER.C6细胞。HEK293细胞系是通过将人类胚胎肾（HEK）细胞与切碎的人类Ad5 DNA共转染而产生的，其中核苷酸1-4344，包括E1区域，被整合到19号染色体上。这些细胞非常多功能，可以在悬浮或贴壁状态下培养，并且可以使用无血清或含血清的培养基。据预测，HEK293细胞的悬浮培养可以达到高达10,000升的规模，病毒产量在10^9到10^10 VP/mL之间。

HEK293细胞系的一个严重缺点是在生产过程中由于同源重组事件频繁产生具有复制能力的腺病毒（RCA）。PER.C6细胞系的开发旨在减少生产过程中RCA出现的风险。PER.C6细胞系包含Ad5 E1A和E1B编码序列（核苷酸459-3510），在人类磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子的控制下。通过将细胞与没有序列重叠的腺病毒载体结合，克服了RCA的产生。PER.C6细胞可以在有无血清的悬浮培养中生长，已成为行业标准。

第二代腺病毒载体，缺乏E1、E2和E4区域，可以与源自HeLa和Vero细胞的跨补细胞系一起生产。已经开发了细胞系来生产E2缺陷的腺病毒载体和E4缺陷的腺病毒载体。基于HEK293、911和E1修饰的A549细胞的细胞系也已被生成，以允许第二代腺病毒载体的传播。

第三代或无病毒载体，除了对病毒DNA复制和包装所必需的顺式作用序列外，所有基因都被移除。由于需要一个适当的生产细胞系来提供所有必要的病毒元素，载体生产变得复杂。一些腺病毒蛋白的细胞毒性可能是创建补充这些载体的细胞系工作失败的最可能原因。因此，有必要提供辅助腺病毒载体（HV），它提供病毒粒子所需的包装蛋白。生产细胞系源自293细胞，并表达Cre重组酶，而HV被修饰为包含包装位点周围的loxP位点。在293Cre细胞中，包装信号被有效地切除，防止辅助病毒基因组被包装。然而，切除效率并不完美，与HV的污染是一个严重的问题，报告的水平在0.01-1%之间。

腺病毒载体的滴度受到多种因素的影响，包括感染的多重性（MOI）、收获时间（TOH）和感染时的细胞浓度（CCI）。一旦生产细胞被腺病毒载体接种，感染可以迅速发生，大约需要48小时完成一个感染周期。因此，制造过程被配置为单轮感染周期，MOI>1以确保所有细胞都被感染。应为每个系统确定最佳MOI；然而，Ad5培养过程的典型值范围是每个细胞10到200个病毒颗粒，结果是放大比率>200。

可以在搅拌罐生物反应器中培养适应悬浮培养的Per.C6和293细胞。当细胞在批量培养中生长时，病毒生产的最佳细胞密度约为5×10^5细胞/mL，比可能的理论最大细胞密度低一个数量级。这被称为“细胞密度效应”。细胞代谢受到营养耗尽和代谢物积累的阻碍，使细胞无法在高密度下支持病毒生产。在感染时交换介质可以减少细胞密度效应，因为这补充了底物并去除了代谢物。当使用连续培养模式时，密度超过5×10^6细胞/mL，规模从3到20升。通过替换至少90%的介质，可以实现最佳病毒生产，每毫升1×10^6细胞。通过优化生物反应器中的物理化学条件可以显著提高病毒滴度。温度、pH值、溶解氧（DO）和部分CO2压力（pCO2）都已被证明是细胞生长、代谢和腺病毒生产的重要参数。

4.腺相关病毒

腺相关病毒（AAV）是一种小的、自然复制缺陷病毒，最初在1965年作为腺病毒的共感染因子被发现。为了在宿主细胞核内复制，AAV需要腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒的帮助，或某种形式的基因毒性应激。有11种不同的AAV血清型和100多种AAV变体，尽管血清型AAV6几乎与AAV1相同，AAV10和AAV11的表征不是很好。每种血清型都有自己的特征衣壳，对某些宿主细胞受体有特殊的亲和力，允许它被用来针对各种组织类型。AAV基因组由单链DNA组成，大约5 kb长。基因组缺乏病毒复制和表达自身基因组所需的基本基因。腺病毒从E1、E2a、E4和VA RNA基因提供这些功能。AAV基因组包含四个已知的开放阅读框（ORF），四个复制基因（rep）包含在第一个ORF中，编码三个病毒衣壳蛋白的cap基因位于第二个ORF，第三个和第四个ORF上的亚基因组mRNA被转录以产生组装激活蛋白（AAP）。基因组的两端都由倒置末端重复（ITR）序列所包围，这些序列作为复制的自我启动结构，并提供Rep介导的包装信号。

4.1.腺相关病毒载体在基因治疗中的应用

从AAV制作载体的过程始于删除编码Rep和Cap蛋白的基因。这种删除提供了大约5 kb的包装空间，用于外来DNA。新的DNA被插入到只包含ITRs的“剥离”病毒中。ITRs包含在辅助病毒存在下复制和包装所需的所有顺式作用元素。Rep和Cap蛋白和所有必要的腺病毒辅助基因在一到两个质粒上表达。从质粒上表达Ad基因消除了与野生型腺病毒共感染的需要。

4.2.腺相关病毒载体生产

生产AAV载体的三种不同生产系统。传统方法利用哺乳动物细胞的瞬时转染，最常见的是HEK293细胞。细胞被共转染三种质粒，以等摩尔比包含rAAV载体（即，由ITRs包围的转基因）、rep和cap基因，以及腺病毒辅助基因E1、E2a、E4和VA RNA。存在该协议的变体，使用双质粒系统，将包装和辅助功能合并到单个质粒上，或四质粒系统将rep和cap基因分别放置在不同的质粒上。通过添加酵母提取物（酵母素、Trypton N1或两者）可以增强rAAV的生产，这可以增加2.8至3.4倍的生产产量。

无血清悬浮培养已成功用于通过瞬时转染生产rAAV载体。研究表明，可以使用20升WAVE生物反应器成功生产rAAV载体，病毒产量为10^14 VG/L。该系统可能被扩大到100升，这对于涉及相对较低剂量的计划和LCA2等罕见疾病适应症是足够的。然而，对于成功的临床计划，特别是进入后期临床试验的，以及针对患者数量更多和/或每个患者需要更高载体剂量的疾病应用，预计需要增加一个到两个数量级的生产能力，以满足基因治疗可能针对的不断增加的疾病适应症的数量。通过增加生产细胞的比例可以实现载体滴度的增加。尽管获得了高转染效率和名义载体产量，研究表明只有5%-10%的细胞似乎能产生可测量水平的组装AAV衣壳。

作为复杂瞬时转染方法的替代方案，可以降低成本的是开发稳定生产细胞系。这些细胞将病毒和货物基因整合到细胞中，消除了瞬时转染的需要，并消除了批次间差异。已从A549细胞和HeLa细胞开发生产细胞系。包装细胞包含包含cap、rep和由ITR序列包围的转基因盒以及可选择标记基因的质粒。通过感染提供辅助病毒蛋白的复制能力Ad来启动AAV生产。生产细胞系已适应无血清悬浮培养，并可在生物反应器中培养，产量为每15升规模的10^4病毒颗粒/细胞，有潜力扩大到500升。其他研究表明，可以在250升搅拌罐反应器中从生产细胞中生产rAAV，没有预见到扩大到商业规模2000升生物反应器或更大的障碍。

杆状病毒表达载体系统（BEVS）是另一个已被成功用于生产rAAV载体的平台。使用BEVS的主要优点是不需要腺病毒辅助病毒。第一代BEVS需要将三杆状病毒表达载体（BEVs）共感染S. frugiperda（Sf9）细胞，每个载体提供AAV生成的三个基本基因（rep：Bac-Rep，cap：Bac-Cap，和ITR包围的感兴趣基因：Bac-ITR-GOI）。第一代BEVS受到BEVs的遗传不稳定性的困扰，导致AAV产量和无法生产其他血清型的功能性AAV载体的能力下降。因此，它们没有得到广泛使用。通过开发依赖于一个或两个BEVs的系统，即One-Bac/Mono-Bac和Two-Bac，克服了这些限制。Mono-Bac系统要求Sf9细胞感染带有所有三个基本AAV基因的单个BEV。这是一种与One-Bac1.0协议不同的方法，该协议利用杆状病毒（BV）在稳定的Sf9包装细胞中诱导rep2（AAV2 rep）和capX（X = 感兴趣的血清型）基因。细胞被感染带有ITR包围的转基因盒的单个杆状病毒载体。由BEV编码的即刻-早期转录调节因子1（IE-1）介导的表达增强，从整合的居民基因的扩增和表达中诱导结果。One-Bac 1.0系统生产的AAV2载体颗粒的细胞特异性产量比Three-Bac高出十倍[139]。Two-Bac系统使用一个包含rep和cap表达盒的单个BEV（Bac-Rep-Cap或Bac-In-RepCap），因此现在只需要共感染两个杆状病毒。这种方法可以从悬浮培养的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中每细胞产生7×10^4纯化rAAV颗粒。

5.未来方向和挑战

近年来，获批的基因疗法数量呈指数级增长，指标表明我们将继续看到更多产品成功完成临床试验并上市。慢病毒和腺相关病毒是未来基因疗法研究中最可行的载体选择，因为它们的不良反应有限且免疫原性特征良好。尽管基因疗法最近取得了成功，但一些生物制造挑战仍然存在。迄今为止的许多研究都集中在优化病毒载体的设计和高效的生产者及包装细胞系统上。未来的研究需要关注能够有效监控和控制影响关键质量属性（CQA）的关键过程参数（CPP）的过程分析技术（PAT），从而提高最终产品的一致性并优化生物过程生产方法。国家细胞制造联盟（NCMC）——一个由行业、政府、临床和学术领袖组成的公私合营联盟——在2016年国家路线图（以及随后的2017年和2019年更新）中确定了多个核心挑战，这些挑战涵盖了过程监控和控制、细胞处理和自动化、供应链和运输物流以及劳动力发展，必须在国家层面解决，以实现细胞和基因制造的未来。在确定的核心挑战中包括：（i）缺乏足够的生物加工模型来预测制造条件和材料对细胞行为的影响；（ii）缺乏足够的替代标记物来理解细胞关键质量属性（CQAs）；（iii）缺乏足够的过程分析技术（PAT）和检测细胞特性的检测方法。这些挑战——是行业、学术和政府利益相关者确定的最关键研究和发展领域——需要在人工智能（AI）（包括机器学习理论和自动化机器人学及控制学）、数据分析和预测建模方面具有显著的技能。过程控制需要超越传统的物理化学过程控制参数（pH、溶解O2和温度），并纳入组学、实时细胞代谢物分析以及内源性因素、表面标记物和基因表达的非破坏性测量。新的PAT将阐明哪些制造或过程变量可以产生具有适当CQAs的一致且可复制的产品。这反过来，又可以导致基于质量的设计（QbD）制造过程，从而提高大规模、可复制、低成本生产高质量和安全基因疗法的能力。

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