牙周炎深度解析：干细胞与骨健康的秘密联系

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1.引言

牙周炎是一种与微生物失衡相关的慢性、多因素炎症状况，它对牙周附着装置造成不可逆的损害。它主要由引起大量细胞因子、基质降解酶和趋化因子释放的失调牙菌斑引发，导致组织破坏、牙周附着丧失，最终导致牙齿完全丧失。在牙周炎中，有三个不同的阶段：感染、炎症和组织破坏，每个阶段都可以通过不同的生物标志物检测。其他环境因素，如吸烟、系统性疾病如糖尿病或一些遗传因素，可能会影响宿主的炎症和免疫反应。

当失调的微生物群引发牙周炎的发展时，免疫反应将急性炎症转变为慢性炎症。不同的免疫细胞有助于急性先天免疫反应，如自然杀伤细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，以及一大群细胞因子。在微生物攻击后的前24小时内，中性粒细胞作为第一波免疫细胞。相比之下，第二波由48-96小时作用的单核细胞/巨噬细胞系列细胞表现。人们认为失调的微生物群可以通过调节宿主的免疫反应来保护它们的存在。这可以解释为什么牙周细菌能够逃避中性粒细胞介导的炎症反应，并从局部补体刺激中保护自己。因此，通过中性粒细胞介导的反应增加了牙周组织破坏，因为中性粒细胞无法控制失调的微生物攻击。为了破坏一些细菌细胞膜中存在的一些重要蛋白质，中性粒细胞释放弹性蛋白酶，破坏牙周韧带中的弹性蛋白和I-IV型胶原。此外，弹性蛋白酶可以通过加速基质金属蛋白酶（MMPs）级联反应来降解细胞外基质（ECM），导致附着丧失，因此形成袋状。

中性粒细胞活动对牙周炎的严重程度和预后有显著影响。任何偏离控制中性粒细胞活动的情况都会导致牙周组织稳态的干扰，引发牙周组织破坏。中性粒细胞通过释放细胞毒性元素和降解酶（如活性氧（ROS）和MMPs）增加组织破坏，进一步促进牙周组织破坏。活化的中性粒细胞上调核因子κB配体受体激活因子（RANKL）的表达，这导致刺激破骨细胞生成和骨吸收。此外，膜结合RANKL的表达和趋化因子白细胞介素（IL）-17产生细胞的趋化作用有助于破骨细胞性牙槽骨吸收和间接组织破坏。活化的中性粒细胞进一步释放趋化因子，介导T辅助（TH）-1和TH17细胞的募集。TH17反过来通过释放细胞源性细胞因子，如IL-17、干扰素-γ（IFNγ）、CXC趋化因子配体8（CXCL8；也称为IL-8）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和肿瘤坏死因子（TNF）。此外，活化的中性粒细胞分泌细胞因子，允许B细胞的存活、成熟和分化。

牙周细菌及其产物激活单核细胞/巨噬细胞系统，导致大量促炎细胞因子的产生。有两种不同的巨噬细胞表型，促炎（M1）巨噬细胞和抗炎（M2）巨噬细胞。M1和M2之间的转换对于将活动性和非活动性牙周炎之间转换至关重要。巨噬细胞极化为M1受到各种因素的刺激，包括微生物刺激物如脂多糖（LPS）和IFN-γ。M1分泌各种促炎因子，是TNF-α、IL-1β、IL-6、前列腺素E2（PGE2）、MMP-1和MMP-2的主要来源，导致牙周结缔组织和骨吸收的破坏。IFN-γ进一步刺激巨噬细胞产生促炎细胞因子。

在已建立的牙周炎中，最丰富的细胞类型是浆细胞，约占所有细胞的50%，而B细胞约占18%。B细胞的比例比T细胞更重要，而TH细胞的数量多于T细胞毒性细胞。多形核白细胞和巨噬细胞占所有细胞的不到5%。B细胞的激活导致浆细胞的增殖、成熟和分化。浆细胞产生如TNF-α、IL-6、IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）等细胞因子。TNF-α诱导MMPs的表达，从而促进MMPs介导的牙周组织破坏。活化的T和B细胞也是RANKL的来源，导致疾病牙龈组织中的骨吸收。在炎症性骨病中，B细胞显示出最高的RANKL表达，其次是T细胞和单核细胞。

2.生物标志物

牙周病的诊断主要依赖于临床体征和症状，使用替代性临床牙周参数（探针深度、探针出血、临床附着水平和放射学发现）具有低特异性和低敏感性。因此，对能够准确评估牙周病程度和严重性的生物标志物产生了浓厚的兴趣。生物标志物和细胞因子之间存在共同的相关性。生物标志物可以提供准确、可重复和客观的临床观察到的疾病状态的测量。它可以是体内任何生物过程状态的可靠指标。它可用于诊断、分期和确定疾病的预后。理想情况下，测量的生物标志物应该具有高敏感性（在诊断阶段不要错过任何阳性病例），高特异性（避免假阳性），并且它应该随着患者对治疗的反应而改变不同治疗阶段。细胞因子是小的、基于膜的蛋白质细胞信号分子，它们协助免疫反应中的细胞间通信，并刺激细胞向炎症、感染和创伤部位移动。细胞因子可以传递不同的信号，用于细胞增殖、存活和分化。

最近，基于口腔液体中可量化生物标志物如细胞因子存在的敏感和特定工具，可以补充并可能在某些情况下取代用于诊断和监测牙周炎的传统临床测量。寻找和评估涉及牙周病的生物标志物不仅有助于区分活动和缓解部位，还将指导临床医生为每个患者量身定制最合适的治疗方案，采用“个性化医疗”方法。最重要的是，它们可以提供有关口腔和系统健康之间可能联系的关键信息。

3.牙周炎的生物标志物

牙周病的生物标志物可以从各种生物样本中收集，包括唾液，它被认为是在局部和系统水平上最常用的生物标志物来源。此外，来自外周血样本的血清或血浆是牙周状况的重要指标。牙龈沟液（GCF）是检测和监测牙周病进展的高度特异性来源。本章将重点介绍与牙周病相关的不同生物标志物，涉及成骨和破骨过程。TNF-α、IL-1、IL-6和IFN-γ，在牙周炎期间最有效的促炎细胞因子，据报道对干细胞的免疫调节能力及其在骨骼重塑中的后续作用产生关键影响。

3.1.唾液生物标志物

唾液被认为是识别和早期诊断各种疾病的关键。它包含近1166种蛋白质，其中许多被认为是牙周病的生物标志物。

3.1.1.软组织炎症的唾液生物标志物

软组织炎症的唾液生物标志物包括β-葡萄糖醛酸酶、C反应蛋白（CRP）、IL-1、IL-6和巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）和TNF-α。IL-8在牙周炎症过程的发病机制中扮演不同角色。IL-8是中性粒细胞、牙龈成纤维细胞、噬菌细胞和单核细胞进入牙龈沟的强大趋化因子。β-葡萄糖醛酸酶和IL-1β是牙周炎严重程度的指标。IL-1β被称为破骨细胞激活因子，具有强大的骨吸收潜力，主要由活化的巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、角质细胞、肥大细胞和内皮细胞产生。IL-1β可以是牙周病检测和进展的特定生物标志物。TNF-α和TNF-β可以刺激破骨细胞前体的增殖和分化，并激活成熟的破骨细胞，有利于骨吸收。TNF-β还可以抑制成骨细胞中的胶原和非胶原蛋白质合成，对骨形成产生负面影响。IFN-γ可以作为促或抗吸收细胞因子，因此在骨吸收的调节中扮演双重角色。TNF-α在减少牙周组织修复能力方面也具有重要作用，其通过诱导成纤维细胞凋亡，特别是在与IL-6和IL-1β水平升高相关时。

其他关键生物标志物是MMPs，特别是MMP-8和MMP-9，由宿主细胞如中性粒细胞和成纤维细胞释放。它们负责将牙周病从简单的牙龈炎发展到牙周炎，因为它们能够分解结缔组织基质，主要是I型和III型胶原。作为最广泛研究的蛋白酶，MMP-8及其唾液和GCF水平可以很好地估计牙周炎的严重程度。同样，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和MCP-4随着牙周炎的进展而增加。Pentraxins是一类多功能分子的超家族，在先天免疫中具有不同的功能，并通过Pentraxin3（PTX3）与牙周炎症相关。唾液中PTX3的水平被认为是牙周疾病活动性的可靠指标，可以揭示有丧失附着风险的部位。相反，IL-35被认为是抑制牙周炎症的细胞因子。

3.1.2.牙槽骨吸收的唾液生物标志物

碱性磷酸酶（ALP）、羧基末端焦磷酸盐吡啶交联的Ⅰ型胶原（ICTP）、RANKL和骨保护素（OPG）都是与骨破坏相关的生物标志物。有报道称ICTP是预测牙周炎未来牙槽骨吸收的可靠指标。另一个在牙周炎期间导致组织损伤的因素是活性氧（ROS）水平的增加，导致氧化应激。唾液中8-羟基-2-脱氧鸟嘌呤的唾液水平，作为氧化应激的一个重要标志物，据报道在牙周炎患者中几乎是健康个体的两倍。Toll样受体（TLRs）是先天免疫的主要组成部分，能够识别病原体相关和损伤相关分子模式。唾液中TLR-2和TLR-4水平的升高可以作为与健康个体相比牙周炎的诊断生物标志物。同时，有报道称慢性牙周炎患者的唾液中可溶性Toll样受体-2（sTLR-2）水平显著降低，由于其耗竭，因此可以作为治疗标志物。唾液中的TNF-α、TNF-β、淋巴毒素和IFN-γ水平进一步反映了成骨和破骨细胞生成。3.1.3.胶原分解产物

这一组包括天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和乳酸脱氢酶（LDH），它们是从受损的牙周组织细胞中释放出来的。这一组的唾液水平反映了炎症、细胞损伤和炎症牙周组织的代谢变化。有趣的是，有报道称唾液LDH、AST和ALT与探针深度和牙龈指数直接相关，这些水平在洁治、根面平整和适当的口腔卫生措施后降低。

3.2.龈沟液

龈沟液是一种生理性液体，代表从健康组织结合上皮或沟纹上皮下的毛细血管渗透梯度中的血清渗出液，或者是在炎症、病变组织中的刺激下产生的炎症渗出液。如前所述，GCF被认为是牙周病的特定生物标志物来源，直接从病变区域获得。GCF中微生物群的失衡和代谢物的变化在健康和牙周炎患者之间可能是诊断和预后牙周病的有价值工具。它们可以用来开发个性化的治疗策略。GCF作为生物标志物来源的主要缺点在于其量小。GCF中几乎有100种成分代表潜在的生物标志物，用于检测、分类、规划治疗或监测对牙周治疗的反应。已识别的生物标志物可以分为三个子组（图1），炎症介质和宿主反应修饰剂，宿主衍生的酶及其抑制剂，以及组织分解的副产品。GCF中IL-1β和IL-6的水平被发现与探针出血的严重程度和增加的袋深度正相关。此外，GCF中的ALP水平与牙周病的严重程度正相关。包括LDH和AST在内的其他酶进一步与疾病严重程度相关。有趣的是，半胱氨酸蛋白酶B水平，一种参与蛋白水解的半胱氨酸蛋白酶，可以预测附着丧失，从而区分牙周炎和牙龈炎。同样，中性粒细胞弹性蛋白酶水平与临床附着丧失正相关。GCF中的组织分解产物也可以作为牙周组织破坏的生物标志物。软骨素-4-硫酸盐，一种主要的糖胺聚糖，被认为是反映牙周病中牙槽骨破坏的最重要生物标志物。对治疗反应不佳的病变部位的软骨素-4-硫酸盐水平明显高于反应良好的部位。此外，软骨素-4-硫酸盐水平与袋深度之间的正相关已被报道。GCF中检测到的不同骨相关生物标志物可以进一步反映牙周病的程度。GCF中骨钙素（OC）、骨连蛋白（ON）和骨桥蛋白（OPN）的水平随着牙周病的进展而增加。它们与牙周炎的临床参数正相关。MMP-8被认为是活跃牙周炎最可靠的指标之一。

图1龈沟液生物标志物示意图

3.2.1.龈沟液中的生物标志物作为牙周炎诊断/预后工具

GCF中存在的具有诊断/预后牙周炎潜力的生物标志物包括IL-1及其类型IL-1α和IL-1β。IL-1α和IL-1β被证明具有区分牙周炎和牙周健康的卓越可能性。通过与IFN-γ和IL-10的结合，这种诊断/预后能力被发现增加和改善。另一个可以帮助诊断/预后牙周炎的多生物标志物模型是IL-1β、IL-8、MMP-13、骨蛋白和骨活化蛋白的组合。

3.3.血液成分（血清或血浆）

血清/血浆中生物标志物的分析可以提供患者全身健康的信息，同时提供牙周炎与不同系统性疾病和因素（如糖尿病、类风湿性关节炎、心血管疾病、妊娠并发症、肥胖以及吸烟之间相互作用的信息。血清或血浆中的牙周炎标志物来源于宿主防御和针对牙周病原体的免疫机制，或直接来源于致病病原体的标志物。系统综述和荟萃分析显示，血浆中C反应蛋白（CRP）水平与牙周炎之间存在强相关性，牙周病患者的CRP血浆水平高于健康牙周患者的CRP水平。此外，侵袭性牙周炎患者的CRP水平显著更高（高出50%）于那些患有牙周炎的患者。牙周炎患者与更高水平的CRP、纤维蛋白原、葡萄糖和IL-18以及更低水平的IL-4之间存在显著相关性。系统综述和荟萃分析进一步表明，与健康个体相比，牙周炎患者表现出更高水平的抵抗素。

4.牙周炎炎症产物对干细胞/祖细胞的影响

由于干细胞具有干细胞性、增殖、迁移、多系分化和免疫调节等特殊潜力，它们被视为治疗炎症诱导的组织损伤的有希望的角色。在牙周炎中，干细胞可以被植入或吸引到感染部位，作为炎症和免疫反应的重要调节器，并加快再生过程。

在感染组织衍生的干细胞中存在健康的干细胞特征，如降低的免疫原性和免疫抑制。对于牙周再生，牙髓间充质干细胞（DMSCs）、非牙源性干细胞和诱导多能干细胞都是有希望的干细胞选择。与牙周炎相关的DMSCs包括牙周韧带干细胞（PDLSCs）、牙龈间充质干细胞（GMSCs）、根尖乳头干细胞（SCAP）和牙髓干细胞（DPSCs）。干细胞和免疫细胞在炎症环境中的相互作用可能与健康条件下大不相同。炎症的干细胞表现出干细胞维持、集落形成、增加的增殖率、多系分化潜力、降低的免疫原性和免疫抑制。

从炎症性牙周韧带中获得的牙周韧带干细胞（iPDLSCs）是再生牙周组织的良好干细胞来源。iPDLSCs以其增加的增殖和迁移潜力而著称，然而它们表现出降低的成骨和免疫抑制质量。发现它们表达高水平的IFN-γ、TNF-α、IL-2和IDO，但IL-10水平低。在大鼠中植入的iPDLSCs成功地在胶原海绵上生成了类似牙周的组织，表明它们在牙周再生中的潜力。此外，来自炎症性牙髓的干细胞（iDPSCs）显示出再生牙周组织的能力。此外，与从健康牙髓中分离的干细胞相比，iDPSCs保持了表面标记表达、增殖能力和多系分化能力。三钙磷酸盐浸渍的iDPSCs促进了根分歧缺陷中牙槽骨的发展。受牙周炎影响的DPSCs和GMSCs表现出比对照组更高的增殖率、成骨潜力和钙化沉积。此外，促炎细胞因子诱导的细胞骨架重塑被认为促进了在炎症环境中的增加获取，展示了它们在牙周再生中的潜力。下面讨论了各种炎症介质对干细胞的影响。

4.1.IL-1

IL-1以相互矛盾的方式影响成骨和骨产生。根据报告，IL-1主要通过非典型Wnt-5a/Ror2途径支持间充质干细胞（MSCs）转化为成骨细胞。IL-1β在生理健康至慢性牙周炎发现的浓度范围内，对牙周韧带干细胞的成骨作用具有双重作用。低剂量的IL-1β通过刺激BMP/Smad信号通路增加PDLSCs成骨。然而，较高水平的IL-1β抑制BMP信号，同时促进核因子κB（NFκ-B）和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路。IL-1可以通过上调Wnt信号通路拮抗剂Dickkopf相关蛋白1（DKK1）和sclerostin，有效地减少成骨细胞生成。IL-1水平也与高炎症环境中的破骨性骨丢失有关。

为了模拟体内牙周炎炎症环境，给予从Sprague-Dawley大鼠自由牙龈组织中分离的牙龈间充质干细胞（GMSCs）牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P. gingivalis-LPS）（10 μg/mL）。使用不同浓度的IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）（0.01-1 μg/mL）来减轻LPS的有害影响。P. gingivalis-LPS治疗损害了细胞计数、集落形成率、细胞迁移率、促炎细胞因子产生、成骨分化相关蛋白/mRNA表达和矿化结节形成。这种效应被剂量和时间依赖的IL-1ra治疗显著逆转。当IL-1ra被添加到LPS诱导的培养基中时，TLR 4和IkB（抑制NF-κB的细胞蛋白）mRNA的表达显著减少。西方印迹分析显示，IL-1ra同样逆转了TLR4/NF-κB激活。

4.2.TNF-α

根据TNF-α的剂量、细胞类型和暴露时间，成骨作用可能被抑制或促进。TNF-α可能通过激活NF-κB和上调BMP-2、osterix (OSX)、Runt相关转录因子2 (RUNX2)、OC和Wnt信号通路的表达来促进成骨分化。已确认10 ng/mL剂量的TNF-α在DPSCs成骨发育过程中激活了NF-kB通路。ALP、RUNX2、BMP-2和Ⅰ型胶原（COL-I）的表达也因TNF-α而增强。因此，TNF-α诱导的成骨分化可以被NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）阻止。TNF-α引起的炎症刺激在骨愈合的初始阶段是必要的，以吸引成骨细胞前体。这在TNF受体缺乏的小鼠中可以看到，在模型构建后的第三天，骨髓腔中仅发育出肉芽组织；然而，在野生型小鼠中，未成熟的成骨细胞在同一时间出现在骨髓空间中。此外，与野生型小鼠相比，TNF受体缺乏的小鼠中COL-I和破骨细胞mRNA表达下调至50%。在缺乏TNF受体的动物中，软骨内成骨被下调，而成骨不受影响。相反，没有膜内成骨生长。在骨愈合过程中，TNF-α及其受体分两个阶段表达。在小鼠模型中，TNF-α浓度在骨折后24小时上升，并在72小时内恢复正常。此时，巨噬细胞和其他炎症细胞主要表达TNF-α。这种短暂的TNF信号被假设释放次级信号分子，具有趋化作用，并招募骨再生细胞。大约两周后，在软骨内成骨发育期间，TNF-α水平再次上升。此时，成骨细胞和其他间充质细胞，包括经历软骨内成骨形成的肥大软骨细胞，产生TNF-α。体外，TNF-α以剂量和时间依赖的方式促进或抑制MSCs基质矿化和成骨分化。在暴露于高剂量TNF-α的细胞培养中RUNX2和OSX水平下降，而ALP酶活性和铝红矿化结节大小在TNF-α治疗7或21天后显著降低。据报道，用10 ng/ml TNF-α处理后人类PDLSCs的增殖显著增加。RUNX2、OC和COL-I也是成骨分化标志物，其基因和蛋白表达水平显著下调。这些发现与Feng等人的发现相反，他们发现长达两小时的TNF处理对DPSC增殖或细胞周期没有影响。长期TNF-α处理抑制MSCs在培养中产生矿化结节的能力。通过NF-κB通路，TNF-α还促进MSCs的生长和免疫抑制，同时它通过增加Wnt信号通路拮抗剂和DKK-1的水平来抑制成骨细胞的形成。在小鼠的无胸腺核中，评估了TNF-α对炎症SCAPs成骨能力的影响。TNF-α对骨形态发生蛋白（BMP）有显著的抑制作用，9介导的炎症SCAPs成骨潜力抑制ALP、OPN和OC活性。这些抑制效应被大量的BMP-9部分抵消，表明BMP-9在慢性炎症诱导的骨修复中的潜在治疗益处。据报道，DMSCs受到污染的微环境的影响。例如，P.gingivalis-LPS显著增强DMSCs的细胞增殖。与IL-1β/TNF-α共培养的PDLSCs也可能增加其增殖率。特别是大肠杆菌-LPS和P. gingivalis-LPS阻止了PDLSC成骨细胞发育。在没有BMP-2这种成骨补充剂的情况下，TNF-α和LPS并不影响人骨髓MSCs成骨标志物的表达。另一方面，在成骨分化培养基中或与BMP-2结合时，TNF-α和LPS增强了ALP活性，随后基质矿化。两种介质显著增加了预成骨细胞的基质矿化，无论培养条件如何。因此，确定炎症因子和致力于成骨系的MSCs显著增强了MSCs中的成骨潜力。此外，与巨噬细胞共培养，在用TNF-α和LPS预处理小鼠MSCs三天后，增强了抗炎M2型巨噬细胞标志物精氨酸酶1和CD206的表达，同时降低了炎症M1型巨噬细胞标志物TNF-α/IL-1ra的表达。与单一治疗对照或IFN和TNF-α的组合相比，MSCs对巨噬细胞的免疫调节显著增强。唯一显示增强成骨分化的MSCs，包括ALP活性和基质矿化，是那些用LPS和TNF-α预处理的。

4.3.IL-1β/TNF-α

在IL-1/TNFα炎症环境中，PDLSCs和GMSCs的表面标志物没有变化。然而，当IL-1和TNF-α的联合刺激超过一定阈值时，它们对细胞增殖和招募的有益影响可能会减少甚至导致干细胞死亡。DMSCs在附近牙周环境中的分化潜力可能受到瞬时和低浓度的促炎细胞因子和微生物病原体的影响。通过增强传统的Wnt/catenin通路和阻断非典型的Wnt/Ca2+通路，IL-1/TNF-α可能抑制PDLSCs成骨。

4.4.IL-6

IL-6对成骨细胞生成的调节起着辅助作用。经过IL-6处理后，来自健康牙髓的DPSCs在成骨分化和成骨细胞标志物OC和RUNX2的表达上有显著提高。IL-6及其可溶性受体（sIL-6R）增强了牙周韧带细胞向成骨细胞的分化能力，通过诱导牙周韧带细胞合成类胰岛素生长因子，也增加了RUNX2和ALP活性。此外，IL-6和sIL-6R显著增强了间充质干细胞（MSCs）的成骨分化和ALP活性。IL-6和IL-6R与MSC成骨发育呈正相关，在骨髓MSCs的成骨分化过程中急剧上升。通过刺激信号转导及转录激活因子（STAT3）通路，IL-6/IL-6R相互作用可以导致骨髓MSCs的成骨细胞分化。在成骨细胞培养中，用IL-6处理的骨细胞的条件培养基诱导了成骨细胞晚期标志物OC的过表达。其他研究表明，IL-6通过激活Src同源2（SHP2）/MAPK激酶/细胞外信号调节激酶（ERK）、Janus激酶（JAK）/STAT3和SHP2/PI3K/Akt2信号通路，导致RUNX2、OSX和OC的下调，对成骨细胞分化产生了有害影响。此外，IL-6还减少了成骨细胞钙化结节的发育和ALP活性。在小鼠中，IL-6的过表达显著促进了破骨细胞生成并减少了成骨细胞生成。

4.5.IL-17

IL-17以两种不同的方式调节成骨细胞。一些证据表明，IL-17上调成骨细胞生成，并能防止牙周炎引起的牙槽骨吸收；其他证据表明，IL-17与成骨细胞生成的下调有关，因此可能促成与牙周炎相关的牙槽骨吸收。在成骨细胞共培养中，IL-17通过与其受体的相互作用增强了MSCs向成骨细胞的分化。此外，IL-17增加了ALP、OC、RUNX2和RANKL的表达，同时减少了体外矿化，揭示了其在成骨细胞生成早期阶段的独特作用。其他研究表明，IL-17对早期和晚期成骨细胞发育产生了积极影响。除了在体外通过成骨细胞介导的破骨细胞生成和在颅骨异常的大鼠中层骨形成外，IL-17还与增强的成骨细胞分化、矿化和增殖有关。相比之下，IL-17降低了体外ALP、OC、RUNX2和OSX的表达，并阻碍了由BMP-2引起的成骨细胞生成。通过激活ERK1、2和JNK/MAPK，IL-17处理的PDLSCs显著降低了它们的成骨潜力，表明它们参与了与牙周炎相关的骨丢失并抑制了大鼠的骨生长。

4.6.IFN-γ

IFN-γ增加了MSCs的增殖和免疫调节活性。低剂量的IFN-γ提高了MSCs的抗原呈递能力，减少了它们的溶解。相反，高剂量可能产生相反的效果。IFN-γ被批准与骨髓MSCs对其免疫抑制T淋巴细胞增殖的能力有关。此外，功能性色氨酸2,3-双加氧酶（IDO）和IL-10可能由骨髓MSCs分泌，作为LPS和IFN-γ的结果。此外，MSCs必须致力于成骨细胞系以增强体内外的骨修复，这需要IFN-γ。在具有突变IFN-γ受体的小鼠中，观察到骨量减少、低骨转换模式、骨形成下降、成骨细胞和破骨细胞数量显著下降以及循环骨形成和吸收标志物水平下降。这些发现表明，IFN-γ信号在治疗骨丢失中可能被显著利用。相反，进一步的结果显示IFN-γ抑制了异体MSCs产生的成骨并通过T细胞激活刺激破骨细胞生成和骨丢失。

5.牙周炎炎症环境对破骨细胞生成的影响

5.1.破骨细胞生成

破骨细胞是吸收性的大（50-100纳米）多核细胞，以其独特的皱褶边缘面对被吸收的骨而闻名。皱褶膜通过大量的H+-ATP酶，将pH值降低到4.5，这是骨基质中钙螯合的最佳条件。破骨细胞通过基于整合素的附着，能够附着在正在吸收的骨表面，围绕降低pH值的区域形成一个紧密的密封。在钙螯合之后，破骨细胞分泌组织蛋白酶K和基质金属蛋白酶来分解基质蛋白。随后通过内吞作用吸收有机和无机吸收副产品。破骨细胞起源于造血干细胞，在包括干细胞因子、IL-3和IL-6等因素的影响下，在骨髓中产生共同的髓系前体细胞。共同髓系前体细胞，反过来，在GM-CSF的影响下产生粒细胞/巨噬细胞前体。粒细胞/巨噬细胞前体进一步分化为破骨细胞前体，单核/巨噬细胞系，在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的影响下，这对破骨细胞的生存和增殖至关重要。M-CSF与其CSF-1受体（c-Fms）的结合可以触发破骨细胞前体中细胞内PI3K和生长因子受体结合蛋白2（Grb 2）的激活，进而激活Akt和ERK信号。M-CSF来自骨环境中的成骨细胞和骨髓基质细胞。

成骨细胞前体分化为活化的破骨细胞是通过OPG/RANKL/RANK轴导向的。OPG、RANKL和RANK都是TNF/受体超家族成员。RANKL与其受体RANK的结合，RANK表达在破骨细胞前体表面，触发信号级联反应，导致破骨细胞前体融合和分化。它还在促进成熟破骨细胞的存活和活性方面发挥作用。RANKL与牙周病中的骨吸收有关。它由牙周组织中的多种细胞表达，包括成骨细胞、骨髓基质细胞、牙龈上皮细胞、成纤维细胞、牙周韧带细胞，以及牙周病中的激活T和B细胞。牙骨质细胞也可以表达RANKL并在体外增强破骨细胞生成。RANKL，由病变牙周环境中的不同细胞表达，与其受体RANK结合激活TNF受体相关因子，导致细胞内信号激活适配器/激酶，如NF-κB和MAPKs，包括p38、JNK和ERK，最终激活转录因子，如NF-κB、激活蛋白-1、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白和活化T细胞核因子1（NFATc1），最终诱导表达破骨细胞生成标志物，包括抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、树突状细胞特异性跨膜蛋白、破骨细胞相关受体（OSCAR）、β3整合素、骨质硬化症相关跨膜蛋白-1、B淋巴细胞诱导成熟蛋白1和组织蛋白酶K。OPG是RANKL受体的诱饵配体，可以通过与破骨细胞前体表面的RANK结合来阻碍和下调破骨细胞分化。OPG由牙周韧带细胞表达，通过它们可以调节破骨细胞生成。

5.2.细胞因子作为牙周炎牙槽骨吸收的标志物

牙周病中破骨细胞生成的过程是由多种细胞因子调节和控制的，因此可以调节牙周病中观察到的牙槽骨吸收。在牙周炎期间促进破骨细胞生成的促炎细胞因子包括IL-1超家族（IL-1ɑ、IL-1β、IL-33、IL-36）、IL-6、IL-8、IL-11、IL-17、IL-22、IL-34和TNF。

5.2.1.IL-1超家族与破骨细胞生成

IL-1在促进牙周炎中破骨细胞生成的作用以前已有记录。在非人灵长类动物中阻断IL-1和TNF与破骨细胞形成和炎症细胞向牙槽骨的进展显著减少有关。此外，IL-1受体拮抗剂在大鼠牙齿移动模型中成功减少了体内破骨细胞的数量。牙周韧带成纤维细胞显著促进了外周血单核细胞在暴露于IL-1β后的破骨细胞分化。IL-1通过促进RANKL表达来增强RANKL诱导的破骨细胞生成。IL-1通过p38 MAPK进一步与成骨细胞中RANKL表达增加相关，因为IL-1β在牙骨质细胞中上调了RANKL表达。此外，IL-1ɑ通过ERK途径在牙周韧带细胞中上调RANKL和下调OPG表达。IL-1可以独立于RANKL/RANK相互作用通过细胞内途径促进破骨细胞生成过程。IL-1与其二聚体受体IL-1R1在破骨细胞前体表面的结合可以上调转录因子，包括JNK、P38和ERK。IL-1还可以上调小眼转录因子，最终导致破骨细胞相关基因的上调，如OSCAR和TRAP。然而，IL-1对破骨细胞前体分化的影响取决于RANKL或TNF-α的存在，它们可以通过c-Fos和NFATc1上调IL-1分泌和IL-1RI表达。RANKL对于骨髓前体细胞对IL-1介导的破骨细胞生成的反应至关重要，通过启动基因，包括编码NFATc1的基因。同样，IL-33也涉及破骨细胞生成的上调。在诱导牙周炎的大鼠牙龈样本中和慢性牙周炎患者的牙龈样本中可以检测到IL-33水平升高。与IL-33类似，它与增强RANKL诱导的破骨细胞生成有关，因为IL-33在体外上调了牙周韧带细胞中的RANKL表达，在成骨细胞中通过ERK和p38 MAPK，以及在牙龈上皮细胞中。与IL-1类似，IL-33可以通过RANKL/RANK相互作用独立的途径上调破骨细胞生成，其中IL-33与其受体的结合可以直接激活破骨细胞生成相关信号分子，包括脾脏相关酪氨酸激酶、磷脂酶Cc2、与Grb2相关的结合蛋白2、MAPK、TGF-β激活的激酶1、NF-kB、IL-33、TNF-α受体相关因子6（TRAF6）、活化T细胞核因子细胞质1、c-Fos、c-Src、组织蛋白酶K和降钙素受体。相反，其他报告表明IL-33与体内破骨细胞数量显著减少有关，并且可以通过阻碍破骨细胞分化因子如NFATc1下调破骨细胞生成过程，同时通过上调促凋亡分子如BAX、Fas和FasL上调破骨细胞凋亡。此外，IL-33在慢性根尖周炎病变中高度表达，与RANKL呈负相关，与OPG表达呈正相关，表明IL-33对牙周炎中的骨丢失具有保护作用。关于IL-33对破骨细胞生成影响的矛盾数据可以追溯到其在牙周病变中的局部浓度。IL-33在高浓度时显著上调牙周韧带细胞培养中RANKL的表达。相反，在IL-33的低浓度下，OPG表达显著增加，这可能抵消破骨细胞生成过程。

IL-36γ 也可能在与牙周相关的牙槽骨丢失中发挥作用。在牙周炎患者的牙龈中观察到 IL-36γ 表达增加，与 RANKL 到 OPG 比例正相关，表明其在 RANKL 介导的破骨细胞生成中的作用。人类口腔牙龈角质形成细胞暴露于牙周病中的主要细菌——Treponema identical 时，通过 NF-κB 和 MAPK 途径，IL-36γ 表达显著增加。

IL-18 是另一种属于 IL-1 细胞因子超家族的促炎细胞因子。慢性牙周炎患者的血清中 IL-18 水平显著更高。慢性牙周炎患者的牙龈沟液中的 IL-18 水平显著更高，并且在牙周治疗后显著降低，表明 IL-18 可能是牙周炎症的有价值的标志物。

5.2.2.IL-6 和破骨细胞生成

IL-6 是一种多功能细胞因子，作为一种促炎细胞因子和调节免疫系统的因子，通过与其受体 IL-6R 相互作用来增强破骨细胞生成，通过上调成骨细胞上的 RANKL 表达。可溶性 IL-6R 在存在 IL-6 的情况下上调与成骨细胞共培养的骨髓细胞中的破骨细胞生成。此外，在体外 IL-6R 抑制中，破骨细胞生成被阻止，并且在大鼠牙周炎模型中显著减少了牙槽骨吸收。IL-6 还可以通过成骨细胞 RANKL 表达以及独立于 RANK/RANKL 相互作用的途径上调破骨细胞生成。

IL-6R 和 IL-11R 都表达在破骨细胞上，并且可以通过糖蛋白 130 信号途径传导信号。没有表达 RANKL 的细胞，IL-6 和 IL-11 可以在 CD14+ 单核细胞中诱导破骨细胞生成。此外，破骨细胞生成被糖蛋白 130 抗体抑制，而不是被 OPG 或 RANK-Fc（重组 RANKL 拮抗剂）抑制，表明 IL-6 可以独立于 RANKL 上调破骨细胞生成。同时，IL-6 的破骨细胞生成效应依赖于环境中 RANKL 的存在。

在体内，IL-6 被证明对生理性骨吸收不重要，但可以刺激成骨细胞骨形成。同时，IL-6 与通过抑制 NF-κB 途径减少的破骨细胞生成相关。得出了 IL-6 在破骨细胞生成中的双重作用。RANKL 的水平对于指导对 IL-6 的细胞反应至关重要。在高水平的 RANKL 存在时，IL-6 和 sIL-6R 通过上调 NF-κB、ERK 和 JNK 磷酸化上调破骨细胞分化。而在低水平的 RANKL 存在时，IL-6 和 sIL-6R 下调破骨细胞分化。

5.2.3.IL-17A 和破骨细胞生成

IL-17A 与大鼠牙周炎模型中牙槽骨破坏增加和破骨细胞数量增加相关。在诱导牙周炎的大鼠中，阻断 IL-17A 显著减少了牙槽骨丢失和破骨细胞数量。IL-17A 可以通过上调 RANKL 来上调破骨细胞生成。IL-17A 能够上调成骨细胞和牙周韧带细胞中的 RANKL 表达。它通过增加体外自噬相关基因表达和蛋白表达来刺激破骨细胞生成。也有报道称，牙周炎相关的 IL-17A 和 RANKL 上调是通过触发髓样细胞上的触发受体-1（TREM-1）介导的。TREM-1 的阻断下调了 IL-17A 和 RANKL 表达；另一方面，OPG 表达上调。

5.2.4.IL-22 和破骨细胞生成

另一个涉及牙周炎相关骨分解的 IL 是 IL-22。牙周炎患者的牙龈中 IL-22 水平显著高于健康个体，与牙周袋深度正相关。从牙周炎患者获得的组织匀浆显著刺激了破骨细胞的功能。这种效应在中和 IL-22 后被阻止，证明了其对破骨细胞功能的影响。IL-22 通过上调 RANKL 表达在体内介导破骨细胞生成。在大鼠实验性牙周病变中，IL-22 和 RANKL 的水平增加与牙槽骨吸收增加相关。此外，体外 IL-22 通过 MAPK 信号途径上调了人类牙周韧带成纤维细胞中的 RANKL 表达。

5.2.5.其他白细胞介素和破骨细胞生成

在牙周炎期间产生的树突状细胞产生的 IL-8 通过刺激炎症细胞分泌 IFN-γ、IL-17、TNF-α、IL-1β 和 RANKL 参与破骨细胞生成的上调。体外，IL-11 通过上调成骨细胞中的 RANKL 表达来上调破骨细胞生成。IL-11 可以独立于 RANK/RANKL 相互作用上调破骨细胞生成。IL-34 也与体外牙周炎中增加的骨吸收相关，因为牙龈成纤维细胞中的 IL-34 表达在 TNF-α 和 IL-1β 处理后上调。在 RANKL 存在的情况下，IL-34 显著上调了骨髓巨噬细胞的破骨细胞生成。

5.2.6.TNF与破骨细胞生成

TNF作用于成骨细胞、基质细胞、通过TNFR1和蛋白激酶A信号通路作用于牙龈上皮细胞，以及骨细胞，以增加RANKL表达。TNF-α能够上调破骨细胞前体上的RANK表达，并使前体细胞对RANKL敏感。IL-1、IL-6和TNF协同刺激破骨细胞生成。此外，TNF可以下调OC、ALP和RUNX2的表达，阻碍成骨细胞的分化。它还可以通过阻碍Wnt信号通路来下调成骨细胞的功能，促进成骨细胞的凋亡，并抑制成骨细胞的作用，进而加剧牙周炎中的骨质流失。TNF单独不能启动破骨细胞生成，RANKL的存在对于TNF介导的破骨细胞生成是必需的，因为RANKL使巨噬细胞对TNF产生反应，进而分化成破骨细胞。尽管一些研究表明TNF可以在RANK/RANKL通路独立的情况下刺激破骨细胞生成，在RANK缺乏的小鼠中，TNF-α未能引发破骨细胞生成。TNF-α和RANKL通过激活NF-kB和应激激活蛋白激酶/JNK对破骨细胞生成具有协同效应。

6.牙周炎炎症环境对骨细胞的影响

牙周炎是一种多方面的疾病，会触发组织和牙齿支持骨的紊乱。在细胞外基质(ECM)产生后，成骨细胞注定要么经历凋亡，要么分化成骨细胞。因此，骨细胞是从骨髓中的间充质干细胞(MSCs)分化而来的成骨细胞系，具有长达25年的寿命。骨细胞通过达到骨表面的树突，即 lacuna-canalicular 系统，相互沟通并与其他细胞介导交叉对话。牙周炎的进展涉及由M-CSF产生引起的破骨细胞生成导致的牙槽骨丢失。有趣的是，骨细胞有助于持续产生M-CSF，增加破骨细胞生成。骨细胞衍生的M-CSF保护免受过量Nox4衍生ROS生成，并维持骨重塑。

破骨细胞生成是由RANKL驱动的，RANKL是一种由成骨细胞和骨细胞合成的膜相关细胞因子，对炎症性骨吸收至关重要，其在牙周炎中的表达增加。骨细胞是骨重塑中RANKL的主要来源，而不是成骨细胞。此外，骨细胞通过上调促炎细胞因子分泌参与发展牙周炎和牙周炎诱导的牙槽骨丢失。TNF-α调节骨细胞产生RANKL。因此，它要么诱导破骨细胞生成，要么促进骨细胞中sclerostin表达，导致破骨细胞生成增加。同时，TNF-α不诱导骨细胞产生M-CSF。

革兰氏阴性细菌的LPS与骨细胞表面的TLR-2相互作用，引发下游MAPK/ERK 1/2信号通路和转录因子，导致IL-6表达上调。IL-6通过糖蛋白130介导的JAK激活，使STAT磷酸化，转移到细胞核并最终增加骨细胞中RANKL的表达。

值得注意的是，牙周炎中RANKL含量的显著增加与OPG水平下调相关。随着RANKL/OPG比率的增加，破骨细胞数量增加，因此骨吸收区域扩大。此外，在小鼠骨细胞中诱导的牙周炎刺激了RANKL表达增加七倍，与破骨细胞数量增加和骨吸收一致。在患有牙周炎的糖尿病大鼠中，骨细胞衍生的RANKL增加，与高破骨细胞活性、破骨细胞数量和骨吸收良好相关。在正常和糖尿病大鼠中消除骨细胞衍生的RANKL导致牙周骨丢失停止。这证明了骨细胞在牙周炎的进展中扮演着重要角色，可以被定义为一个中心RANKL资源。

此外，在小鼠正畸牙齿移动模型中，压缩力通过自噬介导的RANKL分泌增强了骨细胞介导的破骨细胞生成，这一过程通过转录因子E3相关信号传导。RANKL在骨细胞中的亚细胞运输调节机制包括通过树突过程的末端直接细胞间相互作用，以膜结合形式向破骨细胞前体提供RANKL。OPG介导新合成的RANKL在刺激RANK后运输和释放到细胞表面，以调节破骨细胞生成。

另一种骨细胞分泌的分子，硬骨素，是一种主要由骨细胞产生并由SOST基因编码的分泌型糖蛋白，可能与牙周病有关。慢性牙周病患者在健康患者中显示出更高的GCF硬骨素水平。硬骨素表达通过ERK1/2-MAPK在牙槽骨中增加牙周炎的RANKL/OPG比率。在高度纯化的原代骨细胞中，硬骨素表达被TNF-α增强，刺激了破骨细胞的形成。尽管如此，硬骨素抗体（Romosozumab）已被批准用于治疗高骨折风险的绝经后妇女的骨质疏松症。同样，DKK1，一种主要由骨细胞产生的内源性分泌蛋白，刺激TNF-α诱导的骨细胞中的硬骨素以抑制成骨细胞活性。硬骨素被认为是牙周病治疗的有效治疗靶点，因为使用DKK1和硬骨素特异性抗体注意到了牙槽骨量的改善。

在牙周炎中，牙周组织细胞不断暴露于微生物病原体。因此，细胞凋亡被放大，这显著影响了慢性炎症的进展和组织损伤。增加的促炎细胞因子改变了骨细胞的机械敏感性，诱导骨细胞凋亡，并提高了骨细胞衍生的炎症细胞因子和信号分子的表达。LPS暴露可以在骨细胞中引起DNA损伤，并通过激活P53释放衰老相关的分泌表型。这个过程被称为“炎症-衰老”，可能危及骨重塑和稳态。

凋亡的骨细胞可以分泌RANKL，直接调节破骨细胞的形成和骨重塑。凋亡的骨细胞还可以进一步产生凋亡小体，促进破骨细胞前体细胞分化成破骨细胞。此外，凋亡的骨细胞通过激活的Pannexin 1通道释放腺苷三磷酸（ATP），通过ATP受体门控（P2）通道作用于骨系细胞。这种相互作用导致附近表面骨系细胞上调RANKL表达，使巨噬细胞聚集并分化成破骨细胞。

此外，如果巨噬细胞未能清除凋亡的骨细胞，就会发生继发性坏死。这一过程加剧了多种细胞因子的分泌和免疫细胞的聚集，这增强了促炎分子的产生，并刺激邻近细胞分泌RANKL。单核破骨细胞前体细胞产生TNF-α，识别凋亡骨细胞表面的标记，导致增强的破骨细胞形成。已有报道称，细菌刺激和炎症因子可以促进骨细胞凋亡。强调骨细胞凋亡在牙周炎中的作用将有助于理解牙周炎的发生和进展，这将改善未来牙周炎的临床预防、评估和治疗。

7.结论

牙周炎是一种由失调的口腔微生物群引发的炎症性疾病，人们认为它通过失调宿主的免疫反应来保护自己的存在。当免疫细胞无法控制失调的微生物攻击时，就会大量释放细胞因子、基质降解酶和趋化因子。随后，这导致牙周组织破坏增加。牙周炎的三个不同阶段——感染、炎症和组织破坏，可以通过不同的生物标志物来检测，这些标志物可以准确评估牙周病的范围和严重程度。在牙周炎期间释放的几种促炎细胞因子可能对牙槽骨造成巨大损失。选择性抑制这些细胞因子或它们的细胞受体可能有助于减少与牙周炎相关的骨吸收。因此，生物标志物被认为是牙周疾病诊断和预后的有希望的工具，并可用于开发个性化治疗策略，准确、快速和特定的椅旁生物标志物识别可能代表着牙周疾病诊断和预后的未来。

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