中检院综述 | IVT mRNA疫苗质量控制的挑战与策略

导读：COVID-19大流行加速了mRNA疫苗的应用，将质量源于设计（QbD）应用于mRNA疫苗开发，并为其建立标准化质量控制方案对于高质量mRNA疫苗的持续开发至关重要。

2024年，中国食品药品检定研究院（中检院）研究团队在Expert Review of Vaccines（IF:5.5）上发表综述《Research progress on the quality control of mRNA vaccines》，讨论了3种IVT RNA疫苗（线性mRNA、samRNA和circRNA疫苗）质量控制研究进展，总结相关挑战和策略，以期为未来mRNA疫苗质量控制研究提供参考。

近年来，使用LNP作为递送系统的mRNA疫苗技术发展迅速。2023年诺贝尔生理学或医学奖授予Katalin Karikó和Drew Weissman，表彰其发现核苷碱基修饰，开发出有效抗COVID-19 mRNA疫苗。mRNA技术也已应用于心血管、自身免疫性疾病和罕见疾病。

随着RNA化学和疫苗学的不断发展，自扩增mRNA(samRNA)疫苗和环状RNA(circRNA)疫苗技术也显示出广阔的应用潜力。

表1 已批准上市或紧急使用的mRNA疫苗

mRNA疫苗具开发周期短、生产速度快、临床疗效高、免疫原性好、适用于广泛受体群体（无需添加佐剂），且无需具高生物安全水平（不基于活病原体）制造工厂等优势，在传染病预防和治疗性癌症疫苗方面具有巨大应用潜力。但同时也存在挑战，如COVID-19 mRNA疫苗发生肌炎和心包炎的风险、给药途径和靶向递送等。因此，mRNA疫苗质量控制是重要的研究课题。

表2 处于临床试验的mRNA疫苗

线性mRNA和samRNA疫苗生产过程为：制备质粒DNA、制备和纯化线性化DNA模板、体外转录（IVT）、mRNA加工和修饰、mRNA纯化及LNP封装。

图1 线性mRNA和samRNA疫苗生产过程

circRNA疫苗无5′cap结构，依赖IRES启动翻译；缺乏3′poly（A）尾结构，通过环形结构增强稳定性；缺乏5′和3′UTR，但含I类或II类内含子自剪接序列诱导RNA前体环化，还可使用T4 RNA连接酶进行环化。且目前正开发的circRNA疫苗不含修饰核苷酸。

图2 circRNA疫苗生产过程

2020年12月，WHO发布指南“用于预防传染病的mRNA疫苗质量、安全性和有效性评估：监管考虑”，涉及LNP递送、活性免疫、线性mRNA和samRNA疫苗预防人类传染病；提出疫苗生产、质量控制、非临床和临床评估等关键因素的关注领域和监管考虑；及突发公共卫生事件期间快速开发重点疫苗的建议。

2022年2月，美国药典（USP）发布第一版针对线性mRNA和samRNA疫苗的“mRNA疫苗质量分析方法–指南草案”，提供评估如mRNA特性、纯度、含量、物理状态（完整性）和安全性等质量属性的方法。

2023年4月，USP发布第二版指南，用于mRNA疫苗整个生命周期。在质粒DNA模板、mRNA原液和mRNA制剂3个主要阶段进行表征和放行测试。T7 RNA聚合酶残留量作为新质控项，并为每个质控项增加检测方法。如ELISA用于检测残留dsRNA，HPLC与CAD用于定性和定量检测LNP脂质成分。

2024年4月，欧洲药典并行制定一系列3个新通则：人用mRNA疫苗（5.36）；生产人用mRNA疫苗的mRNA（5.39）；制备mRNA的DNA模板（5.40），涉及与mRNA疫苗及其成分生产和控制相关的关键方面。

CDE发布《COVID19预防用疫苗研发技术指导原则（暂行）》，指导紧急情况下mRNA疫苗的研发，明确对mRNA疫苗研究和开发的基本要求。

USP指南第二版基于线性mRNA和samRNA疫苗生产工艺，规定质粒模板、mRNA物质和mRNA药品检测等测试项目，并推荐相应分析方法。

表3 线性mRNA和samRNA疫苗质量控制项目及分析方法

2002年，FDA宣布“21世纪现行药品生产质量管理规范（CGMP）”倡议，将QbD作为新药开发和质量控制工具。在QbD框架下，开发周期从确定患者需求并使用它们来定义目标产品质量概况（QTPP）开始；随后确定产品关键质量属性（CQA）及其使用范围和风险评估，整合有关产品安全性和有效性的临床及非临床数据；后根据对制造过程如何影响产品CQA的理解来定义关键过程参数（CPP）的范围。通过建立CPP和CQA间的数学关系，获得操作层面的疫苗生产过程模型。

WHO指南要求开发、验证分析方法及可接受范围（如精度）。ICH Q14和Q2（R2）指南表明，基于分析质量源于设计（AQbD）和产品生命周期理念的生物制剂分析方法的开发和验证，包括分析靶点概况、技术选择、风险评估、实验设计和优化和持续监测等，为确保分析的长期稳定性提供基础。

CDE指南要求制造商在提交时制定用于测定核酸含量、纯度和生物活性的参考标准品，并提供标准品来源、制备、检测结果、校准过程和稳定性的初步研究数据。为比较不同机构疫苗检测结果，应制定dsRNA和T7 RNA聚合酶等关键残留杂质及体外生物活性的国际或国家参考标准。

用于mRNA疫苗CQA的测试方法仍需优化。如现有加帽效率测试方法难以高分辨率地分离和识别不同帽类似物的RNA片段。

mRNA疫苗生产工艺的设计需全面了解CQA、CPP和CMA间的关系，在疫苗生产过程中引入多种实时监测工具（PAT）确保成品质量，加快mRNA疫苗的开发、生产和审批。

QbD和实验设计（DOE）工具的应用可表征生产过程中CPP对CQA的影响。Bryśkiewicz等人认为，QbD在mRNA-LNP药物产品开发中的实施与递送系统结构和主要治疗靶标密切相关。用于递送RNA的LNP的目标质量概况（QTTP）是安全性、有效性和药物性；CQA包括粒径、PDI、包封效率和LNP脂质含量；CMA包括N/P比、脂质类型和生物可降解性；CPP包括温度、微流体和过滤。由于这些疫苗CQA由CMA和CPP决定，因此它们被用来优化LNP设计。

mRNA疫苗效力主要通过检测体外细胞中蛋白表达进行评估。但蛋白表达以外的因素（如可电离阳离子脂质、主要残留杂质含量）也会影响疫苗免疫原性。因此，开发准确反映体内疫苗活性的体外效价测试方法和标准仍是质量控制的关键瓶颈。

对于主要残留杂质，制定标准化的质量控制方法和质量标准应充分考虑生产过程、杂质的生物效应及对身体的影响。有必要开发和优化残留dsRNA、T7 RNA聚合酶的标准化检测方法和参考范围。

疫苗的稳定性对于确定疫苗保质期和保存条件至关重要。研究发现线性mRNA疫苗中可电离阳离子脂质的叔胺基在长期储存过程中被氧化和水解产生与mRNA反应的活性成分，导致无效翻译。温度、pH、光照、湿度、缓冲液类型、关键储存条件（如冷冻保护剂、分散剂）、反复冻融及其他理化性质等均会影响mRNA疫苗稳定性。此外，应进行线性mRNA疫苗体内稳定性研究，为提高疫苗免疫原性提供参考。

对于LNP新型辅料（如阳离子脂质）应尽可能提供有关生产过程和质量控制的详细信息，包括原材料和中间体。详细描述LNP特征，并具体描述可能影响疫苗质量、安全性和有效性的任何组分特征。LNP中可电离脂质的比例影响mRNA疫苗的包封率、纳米颗粒自组装过程；脂质种类、头部基团电荷和尾部疏水性影响mRNA疫苗的粒径、形态和稳定性。另外，USP第二版指南中增加使用HPLC-CAD对mRNA疫苗脂质成分进行定性和定量检测。

由于samRNA疫苗含编码RNA依赖性RNA聚合酶序列，较长序列使其易降解，因此研究samRNA疫苗稳定性应为优先事项。已经研究某些特定碱基序列或RNA空间结构是否易降解、这些疫苗的降解模式及可用于表征疫苗发生降解的早期和敏感指标。

mRNA序列的准确性、完整性和纯度是samRNA疫苗的CQA。应构建模型来研究、量化CPP和CMA对samRNA疫苗CQA及最终产品质量的影响。Samnuan等人发现，Mg2^＋含量及其与三磷酸核苷的相互作用影响mRNA质量和产量，乙酸根离子对IVT过程的影响较Cl-大，添加乙酸钠不会进一步提高RNA产量，焦磷酸酶对于IVT不是必需的。

关键残留杂质是samRNA疫苗的CQA。不同结构和长度的dsRNA在IVT、mRNA制备过程及体内产生，体内产生激活先天免疫反应，这可能与线性mRNA疫苗不同。因此需进一步研究samRNA疫苗残留dsRNA及T7 RNA聚合酶质量标准。

粒径是samRNA疫苗的CQA，影响药物负载、稳定性、生物分布、细胞摄取、内吞作用和释放及免疫反应等。稳定的粒度分析方法对满足多批次mRNA疫苗产品质量一致性要求至关重要。动态光散射（DLS）被用于确定粒径。但最近使用其他分析技术发现，含不同脂质成分比例的samRNA疫苗表现出非球形、异质性“双核”结构，包埋率低，该结构是否影响DLS确定的粒度及粒度分布结果的准确性仍有待研究。目前与mRNA疫苗相关的指南均未明确提及颗粒形态结构的质量控制。

环化效率是circRNA疫苗的CQA，常使用毛细管电泳（CE）测定，但因mRNA环化前体与circRNA分子量相似，CE结果准确性不高。参考ICH Q2/Q14指南，可结合CE和RP-HPLC进行测定。

RNA经I/II类内含子自剪接环化时，高环化度会导致circRNA产量提高并利于疫苗质量控制。研究表明，较高程度的环化与自剪接内含子及目标RNA序列有关，AI已被用于筛选与目标序列匹配的自剪接内含子序列元件，经实验比对合适序列。

未成功环化的mRNA前体与多个mRNA环化形成多聚体结构，应通过实验确定该结构对疫苗功效的影响及相关质量标准。circRNA疫苗缺乏修饰的核苷酸，IVT过程产生的dsRNA及其质量标准与线性mRNA疫苗不同，需对circRNA疫苗中残留dsRNA的检测方法及相关质量标准进行研究。

尽管circRNA较稳定，但仍可被RNase降解，而基于分子量的方法（如CE）无法区分circRNA和开环circRNA，在开环circRNA 3'端添加poly（A）尾虽有助于确定其在疫苗中的含量，但准确性会受聚腺苷酸化影响。由于二者结构不同，可尝试SEC-HPLC区分。circRNA在长期储存过程中是否与LNP脂质成分反应并影响翻译效率仍有待研究。

表4 mRNA疫苗质量控制研究面临的挑战及策略

[1] Hu C, Bai Y, Liu J, Wang Y, He Q, Zhang X, Cheng F, Xu M, Mao Q, Liang Z. Research progress on the quality control of mRNA vaccines. Expert Rev Vaccines. 2024 Jan-Dec;23(1):570-583. doi: 10.1080/14760584.2024.2354251

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