在生物制药领域，酵母菌是除大肠杆菌外的另一种广泛使用的微生物表达系统。酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。成熟的酵母表达宿主包括毕赤酵母、酿酒酵母和汉逊酵母。其中，毕赤酵母因其生长快、蛋白表达效率高，且易于进行分子遗传学操作等优良特点，被认为是工业上最重要的外源蛋白生产宿主之一。下面主要以毕赤酵母为例，介绍其生产过程、优缺点以及高密度发酵的影响因素。这是毕赤酵母生产过程的起始阶段，通过提供适宜的生长环境和营养条件（如葡萄糖、甘油等速效碳源），使毕赤酵母细胞进行快速的增殖和繁衍。这一阶段通常在摇瓶或发酵罐中进行，但摇瓶更常用于实验室规模的培养和初步筛选。为了解决生物培养过程中摇床常见的培养结果不稳定、摇床连续运转高故障率的问题，西尔曼科技近日推出了其最新研发的生物培养振荡器EM-10。该生物培养振荡器采用了自主研发的ARM控制平台，能够提供精确将温场控制在±0.5℃（at37℃、100rpm），具有媲美航空保温性能，确保实验样本在最佳环境下生长与反应。在细胞增殖到一定阶段后，需要进入分批流加的过渡阶段。这一阶段通常使用甘油或葡萄糖作为碳源，以限制性基质的形式进行补加。补加速率的动力学模型是高效表达的基础，需要精确控制以确保细胞的正常生长和代谢。这是毕赤酵母生产过程中的关键阶段，旨在启动并促进目标蛋白的表达。在此阶段，甲醇被用作特异性诱导剂，替代先前的碳源。毕赤酵母中的醇氧化酶基因（如AOX1）在甲醇存在下被激活，从而驱动外源基因的高效表达。该阶段通常在摇瓶或发酵罐中进行，具体取决于实验或生产的规模。毕赤酵母与细菌相比具有作为真核生物的优点，并在发酵培养方面显示出未开发的潜力。除此之外，毕赤酵母被认为是广泛用于包括饲料、制药、洗涤剂、食品和其他行业在内的各个领域的主要微生物构架，用于生产重组蛋白质。其主要优缺点如下。①具有强效启动子：毕赤酵母含有特有的AOX1强效启动子，它在甲醇中表达的AOX1基因的mRNA占细胞总mRNA的5%、AOX蛋白占细胞总蛋白的30%-40%，表达外源蛋白产量是酿酒酵母的10-100倍，并通过甲醇即可调控基因表达。②高效表达：毕赤酵母能够高效地表达各种类型的蛋白，包括酶、抗体、疫苗等。其表达水平通常可以达到克/ 升的级别，远远高于其他一些表达系统。其最高表达量已经突破20g/L，而CHO细胞的产量普遍在3g/L。③易于培养和操作：毕赤酵母生长速度快，培养条件简单。它可以在普通的发酵罐中进行大规模培养，并且对培养条件的要求不高。目前已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达150g/L以上，表达重组蛋白已成功放大到80,000L。④真核蛋白修饰：毕赤酵母具有真核生物的蛋白加工和修饰能力。这使得表达出的蛋白更接近天然状态，具有更好的生物学活性和稳定性。⑤安全性高：毕赤酵母是一种安全的微生物，不产生毒素和致病性因子。因此，在蛋白表达和生产过程中，不会对人体和环境造成危害。①发酵周期长：发酵虽然能达到非常高的菌体密度，但是发酵周期一般相对原核细胞明显较长，容易被污染，且长时间的发酵也不利于外源蛋白的累积。②甲醇的潜在问题：毕赤酵母不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇，而且大量甲醇的堆放成为潜在风险源。④部分外源表达分泌不足：毕赤酵母表达系统可能由于自身转录机制等原因导致mRNA被切断，导致相应的外源蛋白分泌能力不足。毕赤酵母的高密度发酵是在普通发酵的基础上，通过优化并调控细胞的发酵条件，使细胞在高细胞密度下产生更多的外源蛋白。毕赤酵母的高密度发酵一般分两个阶段进行，首先在碳源为甘油或葡萄糖的培养基中进行的生长阶段，积累足够的细胞密度和生物量，然后再将碳源切换至甲醇进行诱导表达目标蛋白的发酵阶段。这种方式可以提高外源蛋白的表达水平，并且使得毕赤酵母在较短时间内积累高浓度的目标蛋白。在影响毕赤酵母高密度发酵的因素中，培养基成分、温度、pH值、溶氧量、泡沫、甲醇的补料流加方式和培养时间等因素均会在一定程度上影响到外源蛋白的产量。在高密度发酵中，培养基的成分会直接影响毕赤酵母细胞的生长以及外源基因的表达，同时也会影响工程菌的遗传稳定性。因此，毕赤酵母高密度发酵通常会针对不同的研究目的和外源蛋白特性，在选择或设计培养基时进行优化，以达到最佳的发酵效果。温度对毕赤酵母的生长和细胞代谢有着重要影响。一般毕赤酵母所需的生长温度为28～30 ℃，高于32 ℃可能导致细胞死亡。一些研究表明，毕赤酵母在较低的培养温度下发酵可以改善靶蛋白产量，降低细胞死亡率，减少死亡后细胞内蛋白酶向培养基中释放，进而减少外源蛋白的水解，而且在较低的培养温度下，蛋白质折叠应力通常会降低，从而使得毕赤酵母能够更加有效地分泌外源蛋白。在毕赤酵母的发酵过程中，pH值不仅会影响菌体的生长状态，而且对外源蛋白的表达也会产生重要影响。具体来说，主要包括影响细胞内酶的活性，进而影响细胞的新陈代谢，从而使外源蛋白的表达也受到影响；影响细胞膜的通透性，对细胞吸收营养物质和排出代谢产物时产生一定的影响；影响培养基中成分和细胞的代谢产物的离解，从而对细胞吸收营养物质造成影响；影响细胞的代谢过程产生，使细胞代谢产物的含量发生改变。另外，在高密度发酵过程中，为了减少外源蛋白被蛋白酶降解，应避开蛋白酶作用的最适pH值，将pH值设定在偏离外源蛋白等电点处，也会提高外源蛋白的收获率。培养基中溶氧量（DO）对于好氧微生物的生长是非常重要的。毕赤酵母的高密度发酵需要消耗大量的氧气，尤其是在利用甲醇时，溶氧不足会造成有害代谢产物在细胞中积累，产生有害影响。在高密度发酵中，使用发酵罐进行培养可以显著提高外源蛋白的表达水平，通常可高出摇瓶发酵的10～100倍。为了尽可能地提高培养基的溶氧量，生产上采用将纯氧和空气按照一定的比例混合这种通气方式来提高供氧，但是氧浓度太高（超过60%）细胞就会发生氧中毒，一般为保证足够的供氧DO会保持在20%～30%之间。在高密度发酵中，由于需要强烈的搅拌和曝气以及培养基中存在表面活性物质，因此会产生泡沫。泡沫的存在会降低培养物表面的气体交换效率；会将细胞和培养基带到泡沫相中，从而导致生产率降低；还可能导致生产中无菌性的丧失。另外，当气泡破裂时会产生剪切力，损害细胞和（或）任何分泌的蛋白质。消泡可以采取添加消泡剂、机械搅拌或超声波的形式，最常用的方法是添加化学消泡剂。在毕赤酵母的发酵过程中，甲醇起到两种作用：一是作为碳源提供能量；二是作为诱导剂，诱导外源蛋白的表达。因此，在这一过程中，甲醇的补加方式、用量和发酵时间都会影响到细胞的生长状态以及外源蛋白的产量。目前，有几种方法可以用于调节甲醇的添加过程，这包括使用在线和离线甲醇监控仪器来控制流量、通过溶氧水平来控制甲醇的添加以及将甲醇与其他碳源混合后流加等，采用这些方法可以使甲醇的添加更加科学合理，从而提高外源蛋白的表达效率。培养时间是在毕赤酵母表达系统中获得最高蛋白表达水平的最关键因素之一，在毕赤酵母表达系统中，生产时间相对较长（约100 h）。培养时间与酵母细胞的数量和目标蛋白的降解程度有关，有研究表明，巴斯德毕赤酵母细胞的最高生长密度是培养96 h，而最高蛋白表达发生在48h，这表明较长的培养时间很可能会导致所表达蛋白被水解消化，也有其他的研究表明最佳蛋白质表达时间发生在培养72～96 h。[1]【菌周刊】| 基于酵母菌表达体系的菌种建库流程大全.江苏耀海生物制药有限公司.2024年04月24日.[2]发酵工艺：酵母表达系统.发酵大师网.2022年09月28日.[3]毕赤酵母表达系统简介及发酵控制点.Uselong Biotech.2024年08月22日.[4]酵母蛋白表达系统.Uselong Biotech.2023年03月10日.[5]毕赤酵母表达系统的优点与不足.发酵产业.2021年04月14日.[6]【菌周刊】工程菌应用|重组蛋白用毕赤酵母菌株介绍.工程菌星球.2022年12月30日.[7]发酵上游：巴斯德毕赤酵母及其表达系统.发酵大师网.2016年06月20日.[8]一文读懂重组蛋白生产中的毕赤酵母.江苏耀海生物制药有限公司.2024年10月21日.[9]Barone GD, Emmerstorfer-Augustin A, Biundo A, Pisano I, Coccetti P, Mapelli V, Camattari A. Industrial Production of Proteins with Pichia pastoris-Komagataella phaffii. Biomolecules. 2023 Feb 26;13(3):441. doi: 10.3390/biom13030441. PMID: 36979376; PMCID: PMC10046876.[10]李成成,黄义德.毕赤酵母表达系统及其发酵策略[J].福建轻纺,2023,(10):31-36.[11]张欣然,凌焱,杨英.毕赤酵母高效表达外源蛋白的分子水平策略[J].食品与发酵工业,2022,48(17):321-328.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029940.
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