糖尿病足干细胞治疗的进展

摘要：糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病晚期常见的严重并发症，常导致患者反复住院，严重时可引发感染、坏疽甚至截肢等危及生命的情况。尽管治疗糖尿病足的方法众多，但尚无明确有效的方法降低糖尿病足患者的截肢率。近年来，干细胞疗法在DFU治疗中的理解进展，为其作为一种新型治疗方法提供了可能。随着干细胞疗法研究的深入，干细胞有望成为未来治疗DFU的新方法。其治疗效果主要通过促进血管生成、分泌旁分泌因子、控制炎症、促进胶原沉积和调节免疫等途径实现。尽管许多研究证实了干细胞疗法治疗DFU的有效性，但仍需建立标准化治疗方案。本文综述了干细胞疗法治疗DFU的相关研究，探讨了作用机制、干细胞类型和给药方式。

干细胞微信群

扫描二维码，符合加群要求者，

即可加入干细胞治疗的微信群！

1.背景

糖尿病（DM）是一个重要的公共卫生问题，是全球最关键的医疗紧急情况之一。由于现代社会生活水平提高、生活和工作压力增大以及人们对糖尿病的忽视，糖尿病的发病率逐渐增加，发病年龄趋于年轻化。糖尿病是一个在大多数国家迅速增长的流行病。DFU是其主要并发症之一，也是导致患者死亡的主要原因之一，全球患病率约为1.8%-6.3%，约20%的患者面临截肢风险。其中，大部分下肢截肢可以追溯到糖尿病足溃疡，约占85%。DFU的成因众多，但成因和机制尚不明确。大多数人认为DFU的发生主要与周围神经病变、血管病变和足部感染有关。DFU伤口愈合缓慢被认为与其血管生成减少、炎症因子浸润和胶原沉积减少有关。与DM共病的周围血管疾病是DFU患者发病和死亡的重要原因。这也是糖尿病被认为是可以影响所有大小和类型血管的疾病的原因。足部感染也是糖尿病足的常见并发症，与创伤的高血糖环境有关。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等细菌感染在DFU中常见，通常需要抗生素治疗和负压手术清创。

目前，西医治疗的主要原则是控制血糖、控制感染、清除坏死组织、减压和高压氧治疗以及恢复血流重建。然而，对于一些远端动脉狭窄和闭塞，无法进行血管介入或血管旁路手术。更何况，由于病情原因，手术治疗也是不可能的。因此，迫切需要开发一种新的DFU治疗方法，以降低其截肢率。

近年来，对DFU管理的新治疗方式兴趣日益增加，包括局部应用生长因子、新型生物敷料的出现以及干细胞疗法的兴起。以前的研究发现，富含血小板衍生生长因子的生长因子可以用来治疗糖尿病足神经病变性溃疡，通过促进细胞聚集、血管生成和细胞增殖来加速修复伤口的肉芽组织生长。通过组织和生物工程开发，许多可以携带药物和生长因子的敷料被发明出来。一些研究表明，自体富含血小板的凝胶可以显著缩短病程，提高DFU的治愈率，并预防感染。普鲁士蓝纳米颗粒（PBNP）是一种具有良好的生物相容性和强大的活性氧清除能力的铁基材料，含有PBNP的敷料可以通过减少活性氧产生和促进血管生成有效促进DFU的愈合。尽管这些发展充满希望，但值得注意的是，国际糖尿病足工作组对广泛使用改变伤口微生态的药物持谨慎态度，如生长因子和自体富含血小板的凝胶，因为缺乏大规模、随机对照试验的确凿证据。单独使用生长因子无法考虑到伤口愈合过程的复杂性。另一方面，干细胞在这一过程中至关重要，干细胞可以通过改善伤口微环境全面调节组织再生。许多研究表明，使用干细胞移植比单独传统疗法更有效。此外，传统治疗方案与干细胞疗法结合治疗DFU的协同效应也有记录，表明改善了结果。尽管许多研究表明干细胞疗法治疗DFU安全有效，但具体机制和治疗方式尚未完全阐明。因此，本综述将描述干细胞疗法治疗DFU在这两部分的研究进展。

2.干细胞疗法治疗糖尿病足的分子机制

2.1.促进血管生成

伤口愈合是一个复杂的过程，尤其是当高血糖环境影响伤口血管生成时。需要多种细胞和细胞因子之间的协同作用以获得最佳结果。其中，血管内皮生长因子（VEGF）尤为重要。尽管出于伦理原因，胚胎干细胞（ESCs）的使用受到限制，但之前的动物研究表明它们可以增加纤维连接蛋白、VEGF和表皮生长因子（EGF）的表达水平。随着干细胞研究的进展，发现多能干细胞（MSCs）可以分化成血管内皮细胞，这是血管生成的关键步骤。它们可以激活特定的信号通路，例如，肝细胞生长因子（HGF）与c-Met受体结合激活包括PI3K/Akt、MAPK和STAT3在内的多个信号通路，这些通路参与VEGF表达的调节。观察到人间充质干细胞（HMSCs）通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的信号通路分泌VEGF和HGF（图1）。MSCs可以系统性调节受损和缺血组织，上调其中的细胞因子和生长因子，改善伤口的微环境，从而促进糖尿病足伤口的愈合。细胞因子和生长因子通过多种机制发挥作用，包括调节免疫细胞活性和改善血管通透性，也作为信号分子。已经证明VEGF刺激创伤情况下局部血小板衍生生长因子B（PDGF-B）和成纤维细胞生长因子2（FGF-2）的上调，促进骨髓来源细胞聚集，促进伤口愈合和组织重塑。其中，内皮祖细胞（EPCs）和成年骨髓来源的造血干细胞（BMHSCs），可以作为红细胞、血小板和白细胞的前体，被引入伤口局部微环境，观察到它们促进愈合过程和组织再生。MALAT1在DFU患者中的表达被发现下调，而microRNA-205-5p被发现是VEGF蛋白翻译的直接调节器，可以抑制VEGF蛋白的翻译，从而阻碍DFU的愈合。尽管MALAT1与microRNA-205-5p存在竞争关系，MSCs通过表达高水平的MALAT1降低microRNA-205-5p的水平，促进VEGF的产生。此外，观察到糖尿病小鼠皮肤中MALAT1水平的升高增强了I型和III型胶原的表达，导致伤口部位胶原沉积增加和伤口愈合加速，而胶原由成纤维细胞分泌。此外，增加伤口局部MALAT1水平可以大大减少炎症并加速愈合。例如，MSCs中MALAT1的过表达诱导M2型巨噬细胞极化，并降低促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平。因此，MSCs可以通过上述途径促进DFU的愈合。ADSCs已成为治疗糖尿病足溃疡的有希望的治疗策略，主要因为它们能够通过表达转录因子Nrf2增强血管生成和内皮祖细胞的增殖。转录因子Nrf2依赖于血红素氧合酶-1（HO-1），其主要作用是促进血管生成和血管生成因子的表达增加。已证明BMMSCs中HO-1的过表达通过Akt信号通路促进BMMSCs增殖并增强BMMSCs分泌VEGF。这一系列事件最终导致伤口溃疡修复的显著改善。MFG-E8对VEGF诱导的AKT磷酸化至关重要，并且在血管周围和血管内都有表达。一项研究已证实BMMSCs可以过表达MFG-E8以增强血管生成，进一步强调干细胞疗法在治疗DFU等慢性伤口中的潜力。在DFU中，c-Jun的表达也减少，发现局部皮下注射过表达c-Jun的HUC-MSCs通过增加PDGFA和HGF水平加速血管生成和再上皮化。激活蛋白1（AP1）代表MAPKs的主要下游效应器之一。c-Jun，AP-1的主要组成部分，是细胞增殖的重要调节器。研究表明，糖尿病慢性溃疡中增加的MMP-2和MMP-9可以通过降解皮肤细胞外基质（ECM）减缓伤口愈合。相比之下，已证明AP-1主要调节糖尿病伤口中MMP-2和MMP-9的转录。MSCs中c-Jun的过表达可能通过下调MMP-2和MMP-9的表达促进伤口修复。

图1 间充质干细胞（MSCs）增强肝细胞生长因子（HGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的机制。

2.2.控制炎症和调节免疫以促进伤口修复

长期炎症可以创造一个低氧环境，并导致血管生成信号的异常产生。移植干细胞的抗炎和免疫调节效应被认为是干细胞疗法恢复效应的潜在机制。免疫系统由轻微炎症调节，这在消除病原体、加速组织修复和维持稳态中起着至关重要的作用。然而，持续和严重的炎症是延迟愈合或不愈合糖尿病足溃疡（DFU）的主要原因。免疫抑制和长期炎症并存并不罕见。严重的免疫反应可能导致严重的全身性炎症或过敏性状况的发展，而免疫反应减弱可能导致严重或复发性感染的发生。因此，需要确保伤口的促炎和抗炎方面处于平衡状态。进行了一项研究，以调查胚胎干细胞提取物在治疗糖尿病足溃疡中的疗效。结果显示，这些提取物的局部应用导致CD45+炎症细胞和干扰素-α（IFN-α）减少，同时调节性T细胞（Tregs）、增殖Ki-67+细胞和内皮细胞标记CD31增加。这表明胚胎干细胞可以通过调节免疫反应促进伤口愈合。先前的研究表明，间充质干细胞（MSCs）可以减少局部促炎反应并抑制CD45表达，展示了MSCs在修复DFU中的抗炎效应。在DFU中观察到CCL2水平降低，其表达增强可以通过血管新生和胶原蛋白积累的正常化来促进伤口愈合。发现局部给药MSCs后CCL2表达显著升高。CCL2受体在巨噬细胞上表达，这些巨噬细胞分泌VEGF和TGF-β，而巨噬细胞水平在DFU中降低。相反，一些研究表明MSCs可以在糖尿病伤口部位增加VEGF和TGF-β水平。因此，局部应用干细胞可能通过增加CCL2促进巨噬细胞聚集和VEGF及TGF-β的生长。转录因子Nrf2直接调节表皮角质形成细胞分泌CCL2。反过来，CCL2可以调节损伤部位巨噬细胞产生的表皮生长因子（EGF），进而刺激角质形成细胞的增殖。因此，推测MSCs可能通过促进角质形成细胞的功能恢复增强CCL2分泌，从而逆转巨噬细胞浸润的减少，并最终促进溃疡修复。此外，高血糖已被证明可以减少内皮祖细胞（EPCs）的数量，损害它们的功能和聚集能力。糖尿病小鼠中CCL2的表达增加进一步促进了EPCs在伤口部位的积累，从而促进新内膜形成。糖尿病中的慢性不愈合伤口以促炎细胞因子的升高为特征，包括IL-1、IFN-γ、TNF-α和IL-6。这些细胞因子主要由活化的巨噬细胞产生，在调节免疫细胞中起着关键作用。局部应用MSCs可能通过分泌IL-10减轻炎症反应。发现与IL-10抗体联合使用胎盘源性间充质干细胞（PMSCs）的治疗显著减缓了DFU的愈合。观察到PMSCs强烈抑制皮肤成纤维细胞中脂多糖（LPS）诱导的NF-kB激活（Varela等人，2019年）。虽然NF-kB在调节IL1、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子的产生中起着关键作用，但间充质干细胞（MSCs）通过减少伤口区域促炎细胞因子的释放和促进抗炎细胞因子的产生来促进皮肤伤口愈合。巨噬细胞有多种类型，不同表型具有不同的作用。巨噬细胞可分为两个主要表型：M1和M2。M1巨噬细胞由促炎细胞因子激活。相反，抗炎细胞因子可以诱导巨噬细胞从M1向M2表型转变。研究表明，M2巨噬细胞促进血管生成，减少神经损伤，并抑制炎症，局部应用干细胞到伤口已被证明可以诱导巨噬细胞向抗炎表型（M2）转变。

3.细胞机制

3.1.分化细胞和前胶原沉积

伤口愈合是一个复杂的过程，包括稳态、炎症、增殖和重塑期。在前两个阶段，MSCs促进凝血并控制炎症。在增殖阶段，MSCs也发挥着关键作用。在这个阶段，上皮细胞进行增殖和修复，并合成胶原和其他细胞外基质蛋白。MSCs是具有自我调节和增殖能力的前体细胞。人间充质干细胞（HMSCs）可以积极分化为上皮细胞和内皮细胞，HMSCs与ADSCs共享共同属性，使它们能够发展成为内皮细胞和新血管生成。它们转化为内皮细胞的具体途径尚未完全表征。已经显示，MAPK/ERK信号通路促进VEGF诱导的BM-MSC向内皮细胞分化，而PI3K信号通路调节ADSC向内皮细胞分化。

胶原的产生和分布主要在皮肤的真皮层，由成纤维细胞释放，与皮肤损伤的愈合密切相关。间充质干细胞（MSCs）可能增加胶原的产生，并促进糖尿病足溃疡（DFU）中胶原的形成。糖尿病足伤口中的脂肪源性干细胞（ADSCs）直接转化为成纤维细胞，并显著促进I型胶原和III型胶原的表达。已有研究表明，来自糖尿病足组织的成纤维细胞显示出减少的增殖能力和产生较少的生长因子。人间充质干细胞（HMSCs）可以显著增加糖尿病成纤维细胞的细胞外基质（ECM）产生。因此，MSCs可能通过刺激成纤维细胞增殖和功能恢复来促进肉芽组织生长。这反过来又刺激成纤维细胞释放更多的ECM和生长因子，从而促进组织修复（图2）（表1）。

4.干细胞的分类

4.1.间充质干细胞（MSCs）

MSCs广泛存在于广泛分布的结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、脂肪、胎盘、脐带和羊水中提取。由于其在人体中含量巨大、易于获取和经济性，它是研究中最常用的干细胞类型。其中，骨髓间充质干细胞（BMMSCs）和脂肪源性间充质干细胞（ADSC）是使用时间最长的干细胞来源。已有研究发现MSCs可以迁移到皮肤的真皮层，并在慢性伤口中经历表型变化或衰老。鉴于骨髓细胞的高度可塑性，推测它们有潜力生成新的皮肤细胞。大量证据表明，BMMSCs的给药可以有效增强伤口愈合，并促进受损皮肤的重建，其对慢性不愈合伤口的治疗是安全有效的，伤口越大，需要的细胞越多。当DFU与下肢缺血结合时，外周血来源的MSCs可以有效促进伤口愈合并降低截肢率。治疗是通过将药物肌肉注射到DFU和下肢缺血病患者的缺血下肢和足部。结果表明，这种干预能够防止足部和下肢截肢，并提高生活质量。此外，该方法可能被认为是治疗下肢缺血病的安全有效方法。相比之下，脂肪源性间充质干细胞（AMSCs）被认为是治疗慢性病的理想细胞治疗方法，因为它们的位置浅表、易于获取、来源丰富，大约是BMSCs免疫抑制活性的三倍，并且由于AMSCs的细胞分裂能力更大。伦理方面更容易通过，因为AMSCs是从自体成人脂肪中获得的。此外，几项研究表明AMSCs能够通过刺激上皮和肉芽组织的形成，通过其抗炎和抗凋亡效应以及促血管生成来促进伤口愈合。然而，自体AMSCs在糖尿病细胞治疗中的应用受到糖尿病效应的限制。因此，在应用之前需要进行干预以增强细胞功能。例如，向AMSCs中添加富含血小板的血浆，将AMSCs嵌入自体富含血小板的纤维蛋白（PRF）中等。人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）是一种具有高分化潜力的祖细胞，可以促进新血管的形成并改善组织再生。此外，其衍生的外泌体稳定且免疫原性低，能够运输具有不同作用的多功能蛋白和生长因子，不仅如此，它还可以调节BMMSCs的增殖和分化。尽管骨髓目前是MSCs的主要来源，但许多研究表明胎盘源性干细胞（PDMSCs）可能是一个更好的选择。它容易获取，可以分离出许多细胞，免疫原性较低，排斥反应较少。此外，PDMSCs可以分化成多种细胞类型。

4.2.单核细胞（MNC）

MNC通常分为两个主要来源：骨髓和外周血。这两种类型都具有自我更新、分化和增殖的能力。它们可以在某些条件下进一步区分为特定的细胞类型，如平滑肌细胞和血管内皮细胞，并且也可以分泌细胞因子以促进伤口愈合。一项临床研究证明了自体外周血MNC治疗DFU的安全性和有效性。试验显示，应用自体外周血MSCs显著降低了DFU患者的截肢率。然而，还进行了额外的随机研究，以评估肌肉注射BMMNC和BMMSCs治疗糖尿病临界肢体缺血和足部溃疡患者的慢性伤口的疗效。结果表明，虽然两种方法都减轻了疼痛并改善了踝臂指数（ABI）和经皮氧分压（tcPO2），但灌注BMMNCs在促进伤口愈合和改善灌注方面的效果不如BMMSCs。这一发现也可以解释为什么目前对MSC研究的关注更多。

4.3.胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）

胚胎干细胞（ESCs）是多能干细胞；它们是从早期发育的囊胚内细胞群或体外受精胚胎中分离出来的。它们具有自我更新能力，能够分化成任何细胞系。已经证明，未分化的ESCs的局部给药可以加速糖尿病小鼠的伤口愈合，促进生长因子的分泌，再上皮化，并加速伤口愈合，其提取物具有抗炎和免疫调节特性。然而，由于其伦理问题以及其过度的增殖和分化能力，可能导致免疫排斥或诱发肿瘤形成。与ESCs类似，iPSCs具有多能性和自我更新能力，以及分化成有机体各种细胞类型的潜力。它们理论上可以从各种成人组织中获得，包括皮肤，因此在伦理上比ESCs争议较小，iPSCs在组织再生和慢性伤口愈合方面比其他干细胞更有优势。iPSC衍生的终末分化细胞可以通过分泌多种生长因子和细胞因子来补偿糖尿病足患者细胞因子的不足水平，从而促进伤口愈合。然而，iPSC在器官三维打印、伤口愈合和血管生成领域的研究仍处于临床前阶段，如果可能用于临床，其安全性需要进一步评估（表2）。

5.给药途径

干细胞治疗可以分为两种主要方法：局部和全身给药。文献综述表明，这两种途径都促进了糖尿病足溃疡（DFU）的愈合。通常，局部注射是最常见的细胞递送方法。在临床研究中，肌肉内注射是最常用的，而在临床前研究中，皮内和皮下注射是最普遍的。与静脉给药相比，局部注射减少了干细胞进行趋化和归巢到目标器官的联系，有效地增加了目标器官中干细胞的浓度。这种方法还可以通过刺激细胞外基质的分泌和组织的再生来加速愈合过程和改善移植物存活。在全身途径中，干细胞可以通过动脉或静脉给药。已经表明，这种方法具有免疫调节作用，并且可以调节血糖。然而，血管内给药增加了微血栓形成的风险，可能与给药剂量有关。与局部注射和静脉治疗相比，药物的局部伤口应用具有更好的安全档案，更直接和方便。将干细胞制剂局部应用于伤口，并与增强干细胞活性和更好地控制细胞间距的新载体相结合，是DFU治疗的新方向。大量研究证实，局部给药不仅更安全，而且比全身给药更有效。

6.讨论和结论

总结研究结果表明，干细胞在DFU治疗中具有光明的应用前景。它们主要通过促进血管生成、分泌生长因子、刺激血管分化、抑制炎症、促进胶原沉积和免疫调节发挥作用。已经显示，干细胞在糖尿病伤口愈合和降低截肢率方面是有效的。然而，大多数当前的研究都是临床前的，未来需要进行大规模样本的临床随机对照研究来验证它们的疗效。特别是，应该探索不同干细胞的比较疗效、给药途径和给药剂量，以找到标准化的治疗方案。此外，尽管干细胞的疗效令人兴奋，但与之相关的许多风险。例如，首先，免疫排斥，尽管可以通过免疫抑制治疗减少排斥，但相应增加了感染风险；其次，肿瘤形成的风险，干细胞的无控制增殖调节和免疫调节促进肿瘤形成，它们分泌的多种生长因子促进新生血管生成和免疫调节促进肿瘤发生。此外，还需要制定适当的干细胞生产诊断和治疗标准以及法律法规，以确保临床可行性。糖尿病足溃疡可以通过多种方式治疗，综合治疗在糖尿病足的治疗中更有效。例如，为了提高干细胞移植的存活率，可以进行缺氧预处理，并使用干细胞支架复合物，结合PRP和生物材料更有利于糖尿病足溃疡伤口的愈合。总之，干细胞治疗糖尿病足具有光明的未来，但需要更有效的制剂方法，并且需要进一步的研究来确定治疗所需的最佳干细胞类型、其安全性、适当剂量和最有效的给药途径。

识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入

生物制品微信群！