当前1型糖尿病干细胞治疗的现状

摘要:在过去十年中，胰岛素依赖型糖尿病的细胞疗法发展取得了进展。然而，仍存在需要克服的重要障碍。已经开发了将多能干细胞分化为胰腺前体细胞或完全分化的β细胞的协议。产生的胰岛素产生细胞可以控制啮齿动物中化学诱导的糖尿病，并成为几项临床试验的主题。然而，这些细胞具有免疫原性，可能对其移植具有致畸性，需要免疫隔离装置和/或免疫抑制。越来越多的研究利用遗传操作来产生免疫逃避细胞。必须提供证据，证明除了预期的益处外，基因操作不会导致任何意外的并发症。间充质干细胞/基质细胞（MSCs）可以提供可行的替代方案。MSCs广泛存在于许多组织中。它们可以通过定向分化形成胰岛素产生细胞。实验证据表明，来自MSCs的同种异体胰岛素产生细胞的移植与减弱的同种异体反应相关，不会干扰其功能。这可以通过未分化为胰岛素产生细胞的MSC亚群的免疫调节功能来解释。最近，从原始MSCs衍生的外泌体已在实验领域用于治疗啮齿动物的糖尿病，取得了不同程度的成功。提出了它们有益功能的几种机制，包括减少胰岛素抵抗、促进自噬和增加T调节细胞群。然而，在这些实验中都没有实现正常血糖。我们建议，从β细胞或胰岛素产生细胞（受过教育的）衍生的外泌体比从未分化细胞衍生的外泌体提供更好的治疗效果。

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1.引言

糖尿病（DM）是一种代谢性疾病，是一个主要的健康问题。它是由1型糖尿病（T1DM）中的胰岛素生产不足或2型糖尿病（T2D）中无法利用这种激素引起的。全球范围内，2014年有超过4亿人患有DM，相比之下1980年为1.08亿。如果这种趋势持续下去，预计到2045年这一数字将增加到超过6亿。其中，T1DM约占病例的10%。T1DM的发病机制涉及胰岛中产生胰岛素的β细胞的自身免疫介导破坏。支持T1DM发展的自身免疫基础的证据包括胰岛周围和内部的淋巴细胞浸润以及针对多个胰岛自身抗原的自身抗体的出现。随着β细胞质量的下降，胰岛素分泌减少，直到可用的胰岛素不足以维持正常的血糖水平。外源性胰岛素的给药是T1DM患者的主治疗方法。虽然通过胰岛素治疗可以维持适当的血糖控制，但它未能防止许多受试者的微血管并发症。此外，不准确的胰岛素输送导致缺乏血糖控制和/或低血糖。胰岛移植可以为T1DM患者提供有效的治疗方法。尽管结果很有希望，但胰岛移植的基本问题是免疫抑制的需求和供体供应的稀缺。或者，干细胞衍生的胰岛素产生细胞可以提供无限的供应。为此，已报道使用胚胎、新生儿、诱导多能和间充质/基质细胞，并成为几项系统评价的主题。在本文中，关键的实验发现和相关的临床试验受到批评性评价。目标是确定在糖尿病干细胞疗法变得可靠和可重复之前必须克服的限制。作为细胞疗法的替代方案，讨论了使用干细胞衍生的细胞外囊泡（EVs）作为未来可能性。

2.多能干细胞

人类多能干细胞（hPSCs）包括从胚胎内细胞团衍生的胚胎干细胞（hESCs）和通过体细胞重编程生成的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）。hESCs显示出无限的复制特性，并有潜力分化为任何成人细胞类型。hiPSCs具有与ESCs相同的扩展和分化能力。然而，使用hiPSCs比hESCs涉及的伦理考虑要少。此外，hiPSCs提供了使用自体细胞的机会，因此可以避免同种异体免疫反应。一些研究报道了hESCs和hiPSCs之间的一些差异。这些包括基因表达谱、表观遗传修饰（如DNA甲基化）和遗传稳定性。

2.1.hPSCs分化为胰岛β细胞

在一项关键研究中，Kubo及其同事报告了在培养中使用Activin A从胚胎干细胞（ESCs）发展出明确内胚层。基于这一发现，D'Amour等人开发了将hESCs分化为胰腺前体内胚层细胞（PECs）的协议。作者认为，在移植后，这些细胞在体内环境的影响下进一步成熟。使用四步协议，Rezania等人报告了hESCs在体外高效分化为胰腺前体，这些前体在体内进一步发展为成熟的胰腺内分泌细胞。两年后，同一组研究人员报告了使用模仿胚胎发育的七步协议成功将hESCs分化为胰岛素产生细胞（IPCs）。在第四阶段，获得了胰腺前体，而在第七阶段，产生了成熟的β细胞。Memon和Abdelalim概述了这两种分化产物的比较。总之，hPSCs体外分化为胰腺前体需要2周，而它们分化为胰岛素分泌β细胞的时间更长，需要超过一个月。因此，在移植胰腺前体后3-4个月发生人类C肽分泌，而在移植完全分化的β细胞后大约2周。在体内进一步分化后，胰腺前体产生表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的类胰岛结构。通过移植β细胞，只产生胰岛素。进一步的优化提高了从33%到75%的β细胞生成分化效率。Verhoef等人最近明确了7个分化阶段的病理生理学分解。对于每个阶段，确定了生化途径、细胞标记和所需持续时间。此外，作者提出了一个优化的协议，用于选择性地消除畸胎瘤。

2.2.临床移植hPSC分化产物

从hESCs衍生的胰岛素产生细胞（IPCs）移植面临两个主要挑战：免疫原性和致畸性。因此，这些细胞的移植需要将它们封闭在免疫隔离装置内和/或使用免疫抑制剂。为此，ViaCyte公司（ViaCyte Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）开发了一种免疫保护装置。该装置装载了从hESCs衍生的胰腺前体细胞（PECs）。数据显示，这种组合的皮下移植[VC01TM]控制了啮齿动物中化学诱导的糖尿病。Henry等人和Odorico等人报告了使用该系统进行胰岛替代治疗T1DM患者的首次临床试验结果。这项研究是一项开放标签试验，包括19名患者。观察到结果的高度变异性，可能是由于设备组件的血管化不良和/或异物反应。12周龄的外植体由于缺氧显示最小细胞存活。试验暂停以改进封装装置的配置。在最近的一项试验中，PECs被装载到一个修改过的装置中，该装置具有大孔，允许血管生长到其腔内[VC-02]。目的是通过更好的氧合增强细胞存活，并通过这个开放系统改善代谢交换。然而，该装置不提供免疫保护。必须给予免疫抑制剂以防止同种异体免疫反应。使用这种修改装置的开放标签试验的早期临床结果最近由两组研究人员报告。Shapiro及其同事报告了17名1型糖尿病患者的结果。六名患者在移植后约6个月，在混合餐耐量测试后显示刺激的C肽反应。在1年时，没有可测量C肽反应的受试者被撤出研究，他们的装置被取出。外植体主要由α细胞主导，只有一部分表现出成熟的β细胞表型。作者指出，尽管在这项试点研究中的一些患者中存在可测量的C肽，但并未观察到显著的临床益处。在第二项研究中，Ramzy等人披露了他们使用相同装置治疗15名患者的结果。这些作者报告说，每日胰岛素总需求减少了。只有一名患者在移植后1年减少了约50%的胰岛素需求。尽管这两项研究提供了概念验证，即干细胞衍生的内胚层细胞可以植入T1DM患者并分化为胰岛细胞，但没有报告任何患者实现胰岛素独立。缺乏完全的治疗反应归因于植入细胞数量不足和包膜周围纤维组织沉积。需要进一步优化植入装置。Vertex Pharmaceuticals Incorporated（马萨诸塞州，波士顿，美国）从同种异体多能干细胞中开发了完全分化的IPCs。在I/II期开放标签临床试验（NCT04786262）中，两名T1DM患者因低血糖意识受损而被招募。IPCs被移植到门静脉系统。还必须给予免疫抑制剂。Vertex宣布了第一名患者的早期令人印象深刻的数据。在第270天，患者实现了胰岛素独立，HbA1c水平为5.2%。第二名患者的结果并不理想。到第150天，外源性胰岛素需求仅减少了30%，HbA1c变为7.1%。然而，结果尚未发表。目前，Vertex计划再招募17名患者。这种治疗的缺点是必须免疫抑制。实际上，频繁注射胰岛素与使用免疫抑制剂之间存在权衡。

2.3.人多能干细胞（hPSC）衍生的诱导多能祖细胞（IPCs）的免疫调节作用

为了规避免疫抑制的不利影响，越来越多的研究利用免疫和基因组工程。Sintov等人采用两种方法来识别负责干细胞-胰岛免疫原性的基因：单细胞RNA测序来描述对免疫挑战的反应，以及CRISPR基因组筛选来评估这些反应的潜在来源。最强的效应是干扰素刺激基因表达的上调。分泌的干扰素导致炎症级联反应，激活JAK/STAT通路。建议一个实用且有前景的方法是特别针对JAK/STAT通路的下游组分，通过耗尽趋化因子配体10 [CXCL10]。作者报告称，用细胞追踪紫色预加载的外周血单个核细胞（PBMCs）以测量增殖率，在与CXCL10耗尽的干细胞衍生胰岛共培养时显示出降低的T细胞增殖。此外，这些细胞在移植到人源化小鼠时逃避了异体免疫攻击。同一组研究者采用不同的方法来生成免疫侵袭性人多能干细胞衍生的胰岛。他们观察到针对人类HLAs和PD-LI的靶向不足以保护这些细胞免受异体免疫反应，并建议添加敲入基因产生了局部耐受环境。研究人员进一步基因工程他们的细胞以分泌IL-10、TGFβ和修饰的IL-2。这些细胞的移植治疗了NOD小鼠长达8周的糖尿病。Wang及其同事也基因工程了来自小鼠的间充质干细胞（MSCs）以表达PD-LI和CTLA4-Ig。这些修改的MSCs被用作胰岛移植的辅助细胞。作者报告称，采用这一方案，无论是同种异体还是异种胰岛移植的结果都有所改善，导致糖尿病小鼠的同种异体移植物存活100天而无需免疫抑制。一个开放标签的首次人体试验（NCT05210530）已经开始，以评估CRISPR Therapeutics（波士顿，MA，美国）和Vacate开发的设备安全性和耐受性。该产品（YCTX210A）有两个组成部分：诱导免疫逃避的基因修改的同种异体胰腺内皮细胞和一个输送并保留细胞的穿孔装置。2022年2月宣布了第一位患者接受这种系统治疗。尚未发布结果。细胞的遗传修改可能存在潜在风险。具有肿瘤形成潜力的免疫逃避细胞的移植也可能产生不利结果。必须提供证据，除了预期的好处外，遗传操作不能引起任何不可预见的并发症。

3.间充质干细胞/基质细胞（MSCs）

3.1.一般功能

MSCs广泛存在于许多组织中，并且可以在体外轻易扩增。原始MSCs可以归巢到受损组织，从而加速其修复。这些细胞由于缺乏HLA II类抗原和共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达而具有免疫逃避性。此外，MSCs通过释放可溶性因子以及在被促炎细胞因子激活时通过细胞间接触发挥免疫调节功能。人们假设，在体内给药后，MSCs会通过植入和随后的分化来修复受损组织。然而，许多研究提供了证据，MSCs不容易植入到目标组织中，移植的细胞最终会死亡或被破坏。因此，MSC介导的功能范式已经从细胞植入和分化转向基于分泌体的信号传导。然而，这一概念最近被Boregowda及其同事挑战，他们提出MSCs通过它们的干细胞/祖细胞性质以及它们的旁分泌效应发挥作用。Phinny等人提出，虽然干细胞/祖细胞功能促进细胞修复、血管生成，而旁分泌功能是抗炎和免疫调节的。此外，这些作者证明了TWIST1表达水平可以预测给定MSC群体的治疗功能。高水平的TWIST1 mRNA表达与干细胞/祖细胞功能相关，而低表达水平与它们的旁分泌免疫调节特性相关。因此，有可能选择特定的MSC系以提供所需的功能。最近，Van Grouw及其同事开发了一个预测性机器学习模型来识别MSC免疫调节的效力。他们通过核磁共振识别了它们扩增过程中产生的细胞外代谢物，并通过质谱识别了产生的细胞内代谢物。他们报告说，细胞外代谢物如脯氨酸、苯丙氨酸和丙酮酸以及细胞内代谢物如鞘磷脂的存在可以用来识别具有高免疫调节效力的MSC系。

3.2.未分化的间充质干细胞（MSCs）和糖尿病

MSCs通过多种机制发挥其治疗益处。它们可以归巢到损伤部位，支持胰岛的修复。MSCs还增强了胰岛移植物的血管化。通过它们的免疫调节功能，它们可以为早期1型糖尿病（T1DM）提供治疗手段。基于这些有希望的特性，MSCs用于糖尿病（DM）治疗在几项临床试验中得到了评估。Hu等人随机分配了29名患者：15名接受脐带Wharton's Jelly衍生的MSCs静脉注射，14名接受传统治疗并作为对照组。作者报告称，MSC治疗的患者C肽水平平均增加，胰岛素需求减少。Carlsson及其同事在10名患者中使用了自体骨髓衍生的MSCs。研究者报告称，在1年的随访中，混合餐耐量测试中C肽反应增加。在Araujo及其同事的试验中，13名患者被随机分配：8名接受异体AT衍生的MSCs和维生素D，5名作为对照组。干预后3个月，MSC治疗组的胰岛素需求和糖化血红蛋白水平较低。Izadi等人用自体骨髓衍生的MSCs治疗了11名患者。他们报告称，MSC治疗在早期诊断的T1DM中改善了糖化血红蛋白和C肽水平。还观察到，从促炎细胞因子向抗炎细胞因子的转变。Carlsson等人使用脐带衍生的MSCs治疗了10名早期T1DM患者。他们报告称，治疗组的胰岛素需求没有变化，而对照组增加了10单位/天。He及其同事最近报告了一项全面的系统综述和荟萃分析的结果，测试了MSCs在糖尿病患者中的临床疗效和安全性。这些作者识别了176篇全文论文。然而，由于涉及非人类实验或不是随机和对照的，169项研究被排除在外。报告称MSC输注改善了糖化血红蛋白水平，尽管空腹血糖或C肽水平没有显著差异。尽管这些研究表明，全身MSC给药对早期T1DM的治疗有潜在益处，但仍存在相当多的不确定性，无法得出最终结论。MSCs的来源是异质的，细胞剂量可变，患者数量有限。鉴于这些限制，需要进行许多高质量、大规模的随机研究以得出明确结论。

为了利用它们的免疫调节功能，MSCs在一些最近的报告中与胰岛共同移植。Wang等人从三名计划接受胰岛自体移植的慢性胰腺炎患者中收集了骨髓衍生的MSCs。通过门静脉将胰岛与MSCs共同移植。作者报告称，该程序是安全的。与对照组相比，患者的12个月空腹血糖水平较低，生活质量更好。Ishida及其同事用炎症细胞因子预处理MSCs以增强它们的免疫调节特性。他们将这些预激活的MSCs与胰岛共同移植到门静脉。作者报告称，与未处理的MSCs相比，预处理的MSCs显著改善了移植物存活率，但未处理的MSCs没有。

3.3.分化的MSCs和糖尿病

另一方面，有证据表明，在某些培养条件下，MSCs可以形成不属于中胚层系的细胞。早在2004年，就有三位研究者报告了成功将小鼠骨髓衍生的MSCs（BM-MSCs）分化为产生胰岛素的细胞。这些早期观察结果通过使用脂肪组织衍生的MSCs（AT-MSCs）得到了复制。这些早期发现受到了挑战。有建议称，培养基中的胰岛素可能被这些细胞吸收并储存。Gabr等人提供了概念验证的最终证据。这些研究者将人类BM-MSCs分化为IPCs。在他们的研究中，成功生产IPCs的所有要求都得到了满足。这些发现后来得到了几项研究的确认。虽然骨髓和脂肪组织是最被研究的，但也有其他来源的MSCs被报道可以分化为IPCs。这些包括脐带、羊水、Wharton's jelly和牙髓。储存的脐带衍生的MSCs可以作为其捐赠者在未来需要时的自体来源。最近，使用Wharton's jelly衍生的MSCs生成IPCs的兴趣日益增加。这些细胞具有高达80个群体倍增的高复制能力，没有观察到衰老。

关于MSC衍生的IPCs移植后异体免疫反应的结果是有争议的。将人类MSC衍生的IPCs移植到人源化小鼠中可以提供证据。这样的实验在我们的实验室进行，并最近发表。异体IPCs源自hAT-MSCs被移植到STZ糖尿病人源化小鼠（NOG-EXL小鼠，Taconic，Bioscience，Rensselaer，NY，USA）。总的来说，这项研究的结果证实，将异体hAT-MSCs移植到糖尿病人源化小鼠中可以使其血糖水平正常化。没有检测到异体免疫反应。分化的IPCs仅占移植细胞的约20%。可以假设未分化的群体发挥了免疫调节效应。这一建议与Wu等人的发现一致，他们报告称第三方未分化的MSCs改善了胰岛移植的结果，用于人源化糖尿病小鼠。这项研究表明，对于依赖胰岛素的糖尿病患者，有可能实施无需免疫抑制、封装或遗传操作的细胞治疗。然而，据我们所知，尚未报告使用MSC衍生的IPCs治疗糖尿病的临床试验。

4.干细胞治疗1型糖尿病面临的挑战和局限性

来自多能干细胞的诱导多能祖细胞（IPCs）面临两个重要问题：异体免疫反应和它们潜在的肿瘤形成能力。需要在免疫隔离装置中进行封装或使用免疫抑制。封装有其固有的缺点。需要进一步改进目前可用的封装系统。必须避免细胞缺氧，并确保充分的血管化。由异物组织反应引起的诱导性包囊周围纤维化也必须最小化。如果这些问题没有得到解决，在封装装置内的细胞移植将难以取得令人满意和有意义的结果。终身需要免疫抑制有严重的副作用。此外，一些使用的免疫抑制剂是致糖尿病的。对于临床应用，干细胞衍生IPCs的植入部位带来了额外的挑战。有三个常见的报告部位：门静脉系统、大网膜和皮下组织。门静脉仍然是胰岛移植的首选部位。然而，由于缺氧和血液介导的炎症反应，大量胰岛在注入门静脉后被破坏。然而，在最近的一项研究中，据报道对于胰岛移植，经门静脉灌注提供了比肝外移植更好的植入和功能。大网膜有丰富的血液供应和大的表面积，可以容纳大量的细胞。有两组研究人员报告了成功地将细胞移植到网膜囊中。尽管如此，需要腹腔镜干预。皮下部位容易接近，需要微创手术。这个部位的主要缺点是血液供应差。Yu等人报告说，当细胞与所谓的胰岛活性基质（IVM）混合时，皮下胰岛移植成功。如果这项研究的结果可以使用MSC衍生的IPCs复制，这将是糖尿病细胞治疗应用中的一个重要步骤。仍然需要确定在这种基质中移植的细胞是否有足够的早期氧气供应。干细胞衍生IPCs的总结见表1。

最后，无论干细胞衍生IPCs的来源如何，还必须解决额外的问题。需要量化实现胰岛素独立所需的细胞数量，并确定它们的功能寿命。

5.展望：MSC衍生的外泌体？

细胞外囊泡（EVs）是自然从包括MSCs在内的细胞释放的膜囊泡。它们被包裹在脂质双层中，不能复制，因为它们不包含功能性细胞核。30-100纳米大小的EVs被称为外泌体，这个术语是由Trams等人创造的。外泌体是唯一一类已知从内质网通过内质网膜内陷形成多囊泡体（MVBs）的EVs。外泌体是通过MVBs与质膜融合释放的。已知外泌体作为从分泌细胞到受体细胞的单向传递者，调节它们的功能。这可以通过接触依赖信号[邻分泌信号]、在源附近释放外泌体[旁分泌信号]或通过内分泌信号实现，外泌体随后通过血液系统全身运输以远距离作用。在一项开创性实验中，Valadi等人将小鼠肥大细胞系[Mc/g]衍生的外泌体与人类肥大细胞系（HMC-1）共培养。此后，在人类细胞中鉴定出三种不同的小鼠蛋白。由于肥大细胞衍生的外泌体RNA可以转移到其他肥大细胞而不是CD4+细胞，得出结论外泌体通过特定的受体-配体相互作用调节受体细胞。作者认为，外泌体衍生的miRNAs或mRNAs转移到受体细胞，允许基于基因的哺乳动物细胞间通信，导致调节受体细胞的蛋白质分泌。这一概念后来得到了几位研究人员的支持。还表明MSCs可以比其他细胞产生更多的外泌体。由此产生的外泌体具有与MSCs相似的功能，如促进细胞修复和调节免疫反应。因此，MSC衍生的外泌体已被测试为无细胞治疗，用于治疗各种病理条件。

6.MSC衍生外泌体和糖尿病

作为细胞治疗的替代方案，MSC衍生外泌体在治疗糖尿病方面的潜在作用已在几项实验研究中得到探索。在一项体外研究中，Favaro等人将hBM-MSCs或其衍生的EVs与来自1型糖尿病患者的树突状细胞（DCs）共培养。研究人员报告说，MSCs或其衍生的EVs诱导了分泌IL-10的调节性DCs的形成。他们建议，这些调节性DCs抑制对胰岛抗原的炎症性T细胞反应，可以防止T1DM的进展。Shigemoto-Kuroda等人报告说，hMSC衍生的EVs可以有效地预防NOD/SCID小鼠的自身免疫性糖尿病发作。他们证明，这些EVs抑制了抗原呈递细胞的激活，并抑制了促炎性T细胞的发展。Nojehdehi和同事表明，来自C57BL/6小鼠的ATMSCs衍生的外泌体在给予STZ诱导的糖尿病小鼠的同一株模型时具有免疫调节作用。他们将这一功能归因于T调节细胞群体的增加。Sun等人使用高脂饮食后STZ给药建立了T2DM的大鼠模型。从人脐带MSCs的细胞培养上清中制备外泌体，并以10 mg/kg的剂量每3天通过尾静脉注射到糖尿病Sprague Dawley大鼠中，共5个周期。与对照组相比，用外泌体治疗降低了血糖水平，增强了胰岛素敏感性，并促进了骨骼肌中GLUT4的表达和肝脏中的糖原储存。在另一项实验中，He等人从人脐带干细胞中制备外泌体。

他们通过使用高脂饮食后STZ给药建立了大鼠的T2DM模型。外泌体通过尾静脉以10 mg/kg的剂量在200 μl的PBS中每3天注射一次，持续2个月。外泌体或人MSCs[5×10^6/大鼠]的植入后血糖水平显著降低。腹腔葡萄糖耐受性测试(IPGTT)和腹腔胰岛素耐受性测试(ITT)显示外泌体给药改善了葡萄糖代谢并增加了胰岛素敏感性。此外，外泌体治疗后自噬相关蛋白增加。作者建议外泌体通过促进自噬改善葡萄糖和脂质代谢。Yap等人准备了来自人脐带MSCs的EVs。这些EVs在两种实验设置中使用：体外和体内。在体外研究中，20 μg/ml的EVs给药使人类骨骼肌的葡萄糖摄取增加了80-90%。在体内研究中，大鼠化学诱导糖尿病。糖尿病大鼠通过I.V.每3天接受1 mg/kg体重的EVs治疗，共5个周期。EVs治疗改善了葡萄糖耐受性、糖化血红蛋白和胰岛素敏感性。Sun等人从胰岛素瘤细胞系[MIN6]的条件培养基中分离出外泌体。这些外泌体被注入STZ诱导的糖尿病小鼠体内，改善了葡萄糖耐受性，增加了胰岛素含量，并保留了胰岛的结构。Guo等人将来自小鼠胰岛素瘤细胞系(MIN6)的外泌体与人iPSCs共培养21天。共培养7天后，流式细胞仪检测到外泌体处理的细胞群体中胰岛素阳性细胞的比例为22.3%，而对照组仅为11.9%。处理的iPSCs显示出相关胰岛内分泌基因的更高表达。此外，miR-706、miR-709、miR-466-c-5p和miR-423-5p在外泌体诱导的iPSCs中的表达上调。然后在C57BL/6小鼠中化学诱导糖尿病。糖尿病动物被分为以下3个治疗组：接受iPSCs[1×10^7/小鼠]的组，接受外泌体诱导的iPSCs的组，以及接受siAgo2(Argonaute 2)外泌体诱导的iPSCs以减少miRNA合成的组。三组细胞被植入糖尿病小鼠的肾囊下。与另外两组相比，外泌体诱导的iPSCs中血糖浓度降低了50%。siAgo2处理的外泌体中β细胞特异性基因也有所减少。得出结论，外泌体在体外诱导iPSCs分化，这一过程是由外泌体miRNAs介导的。为了确定最佳的给药途径，人脐带MSC衍生的EVs被标记为碘-124。标记的EVs通过尾静脉I.V.或通过非糖尿病Lewis大鼠的腹腔动脉内动脉注射。PET成像显示，无论注射途径如何，肝脏中主要吸收了给药的外泌体。

值得一提的是，所使用的协议并不统一，建议的可能的治疗益处也各不相同。此外，在所有这些实验中，治疗的糖尿病动物血糖水平都有所降低，但并未达到正常血糖。很可能使用的外泌体来自未分化的MSCs，而不是成熟的β细胞或IPCs。可以合理假设，来自β细胞或人类IPCs（受过教育的外泌体）的外泌体可能会取得更好的治疗效果。Bai等人的实验研究支持这一假设。这些研究者使用了基于Pagliuca等人和Millman等人先前报告的方法的不同分化协议。在最后阶段，分化的iPSCs与来自1×10^5人类β细胞的15 μg/ml的EVs共培养。每3天更换一次EVs，共15天。作者报告说，这种共培养促进了iPSCs向他们所谓的i-β细胞的分化。在体外，这些i-β细胞表现出胰岛β细胞的功能特性。胰岛素的显著上调在miR-212和miR-132抑制剂的存在下被逆转。这些miRs通过稳定NGN3的表达增强β细胞的分化。在体内，2×10^7 i-β细胞被植入STZ诱导的糖尿病SCID小鼠的肾囊下。移植后，在4周的随访期间，血糖水平在所有时间点都正常。然而，作者没有确定或量化与β细胞衍生EVs共培养后其分化的iPSCs的功能改善程度。

7.EVs作为细胞治疗的替代方案

EVs用于糖尿病或其并发症的诊断和治疗的临床前研究已经成为几篇综述的主题。2014年在ClinicalTrials.gov上发布了唯一的临床试验(NCT0213833)。从那时起，没有宣布或报告结果。与此同时，基于干细胞的治疗经验很常见，并且正在不断优化。然而，使用外泌体可以避免与细胞治疗相关的几个问题，特别是坏死和免疫排斥。有了外泌体，就没有形成畸胎瘤的可能性，因为它们没有细胞核。EVs可以储存并用作现成的治疗工具，可以及时交付。外泌体通过静脉注射给药，其应用可以重复而无需侵入性程序。此外，它们具有自主靶向能力，可以被设计为特定分子的载体。尽管如此，由于缺乏标准化的制备或表征方法，EVs的治疗使用具有挑战性。此外，用作外泌体生产来源的MSCs是异质的。因此，制备的样本可能含有EV亚型的混合物。Witwer等人强调需要结合国际细胞治疗学会建议的识别MSCs的最低标准和国际细胞外囊泡学会的推荐，该推荐在2018年更新。通过这种方式，可以为EVs的制备和表征定义一个框架。由于MSC衍生EVs的全球标准化尚未实现，最终产品应通过可重复的测定使用物理、生化和功能属性来定义。

8.结束语

在过去的十年中，糖尿病的干细胞治疗取得了显著进展。然而，在细胞治疗可以可靠地用于糖尿病之前，仍有一些障碍和挑战需要克服。目标是在不进行封装、免疫抑制或基因操作的情况下成功进行细胞移植。为了实现这一目标，使用间充质干细胞（MSC）衍生的胰岛素生成细胞（IPCs）提供了一线希望。与胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）相比，MSCs的致瘤风险可以忽略不计。实验证据表明，这些细胞的异体移植不会引起免疫反应，这可能是基于未分化群体的免疫调节功能。MSC衍生IPCs的免疫调节功能可以进一步增强，以克服1型糖尿病患者的自身免疫反应。MSC临床应用的缺点是它们的异质性，这取决于它们的来源和供体间变异性。目前正在探索对它们的标准化尝试。皮下组织将是细胞移植的最佳部位。然而，血管化不良的问题需要解决。目前正在我们的实验室测试MSC衍生IPCs皮下移植的模型。细胞被移植在一个纤维蛋白基质内。此外，还共同移植了一个小支架以进行药物输送（图1）。

图2 建议的方案，用以探索MSC衍生外泌体的潜在益处。从未分化的MSCs（未受过教育的外泌体）或分化的IPCs（受过教育的外泌体）的条件培养基中提取外泌体，并通过静脉注射到STZ诱导的糖尿病小鼠体内。结果与在肾包膜下进行的细胞移植进行比较。

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