NGS丨学习回顾:核酸提取常见方法与原理

文摘   科学   2024-11-15 19:06   广东  

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核酸是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,所分离的核酸的质量和完整性直接影响研究或诊断结果,因此从复杂的生物样本中分离出高纯度的核酸是确保高灵敏、高精确度检测的关键,是下游核酸检测、研究或产品开发的起点。



简单地讲,核酸提取过程主要包括两个关键步骤:样品的裂解和核酸的纯化。在裂解步骤中,通过特定的方法使样品中的核酸从其原始结构中释放出来,并游离于裂解液体系中。随后,在纯化步骤中,将核酸与裂解体系中的其他成分,包括蛋白质、盐类和其他杂质,彻底分离开来,从而获得高纯度的核酸。





磁珠法(磁性纳米颗粒吸附法)的核心是生物磁珠,生物磁珠是一种新型的功能化固体载体,其表面包被有活性基团,可以与多种生物活性物质发生偶联,兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点,在外磁场的作用下可以定向移动和集中,当撤去外磁场后,稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中,从而使固液相的分离变的十分快捷方便,通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质。




硅胶膜离心柱法核酸提取基本原理是利用一种特殊的玻璃纤维膜(硅胶膜),该膜在高盐条件下能与核酸发生吸附反应,而蛋白质等杂质则不被吸附,从而去除蛋白质等杂质;在低盐条件下与核酸发生解离反应,从而获得分离的DNA。


即样品中的DNA可以特异性结合到硅胶膜上,通过洗涤可以将PCR抑制剂,如:二价阳离子和蛋白质,完全去除,最后结合在离心柱上的纯核酸可用水或试剂盒中的缓冲液进行洗脱收集。



异硫氰酸胍/苯酚法(TRIzol法):


核酸在中性条件下,因磷酸基解离而带负电荷,这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下,磷酸基的负电荷消失,水溶性下降。因此,在酸性酚的处理下,DNA向疏水性的酚层移动,而RNA由于有-OH的存在有亲水性,因此向水层移动。


TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA,有机层主要为DNA和蛋白质。



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