核酸（nucleic acid）：由核苷酸或脱氧核苷酸通过3’，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子，包括核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）两类。具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。
常规的用于分子生物学提取核酸的样本主要包括新鲜的动植物组织样本、细胞样本、血液样本、唾液样本和粪便样本等。宜选用新鲜样本进行核酸提取；若不能马上提取，应分装成小份，按照样本特性与采集情况妥善保存。
在之前的文章中（点击阅读：NGS丨核酸提取常见方法与原理），我们已经介绍过核酸提取包括裂解和分离纯化两个过程，这里我们再回顾一下。
裂解是指通过将细胞进行裂解来释放核酸分子。
因核酸是复杂的生物大分子，通常位于细胞核内，并与各种蛋白质结合在一起。为了获得高质量的核酸分子，必须使得核酸从细胞或其它生物物质中释放出来，即通过将细胞进行裂解来释放核酸分子。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方式实现。
分离或纯化主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。
核酸的高电荷磷酸骨架结构，决定了核酸比蛋白质、多糖、脂肪等其它生物大分子物质更具亲水性，根据组织中各种成分的理化性质不同，来分离组织中的各种多余成分，利用选择性沉淀等方法可以将核酸进行分离与纯化。
评价指标和方法
根据国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会于2019-08-30发布和实施的核酸提取纯化方法评价通则（GB/T 37874-2019），规定了对于分子生物学实验室常规样本（新鲜样本）的核酸（基因组DNA与总RNA）提取纯化方法的一般性评价，包括指标参数和评价方法。（本通则仅适用于评价常规新鲜样本，不适用于病毒核酸、游离DNA、陈旧样本、微量样本、高度降解样本等样本。）
其中指标参数包括核酸完整度、提取产量和核酸纯度，评价方法包括琼脂糖凝胶电泳法评价核酸完整度、荧光定量法评价核酸提取产量以及紫外吸光法评价核酸纯度。
1 核酸完整度
核酸完整度表征提取过程中保持核酸一级结构（序列）完整而不发生改变的程度。
评价参数包括DNA完整度、总RNA完整度（真核生物总RNA完整度和原核生物总RNA完整度）以及总RNA降解。
根据试验条件和核酸样品，可以选择琼脂糖凝胶电泳方法进行核酸完整度测定，根据条带位置和不同条带的荧光亮度分析综合计算评价核酸的完整性。
DNA完整度：用琼脂糖凝胶电泳法检测基因组DNA完整度时，电泳结果为一条清晰明亮的条带，条带拖尾或者弥散代表DNA有部分降解。
真核生物总RNA完整度：用琼脂糖凝胶电泳法检测真核生物总RNA完整度时，电泳结果为清晰的两条条带-28S和18S-核糖体RNA条带。28S和18S核糖体RNA条带清晰，且两条条带的荧光亮度比值（28S：18S）＞1，以满足后续试验的要求。
原核生物总RNA完整度：用琼脂糖凝胶电泳法检测原核生物总RNA完整度时，电泳结果为清晰的两条条带-23S和16S-核糖体RNA条带。23S和16S核糖体RNA条带清晰，且两条条带的荧光亮度比值（23S：16S）>1，该完整度可以满足绝大部分后续试验的要求。
总RNA降解：用琼脂糖凝胶电泳法检测，如果电泳条带弥散，没有清晰的核糖体RNA条带，为部分降解的RNA样品；电泳条带呈现极低分子质量处的弥散状，为完全降解的RNA样品。
2 提取产量
提取产量是指单位样本中提取得到的核酸（DNA或RNA）的总质量。该指标用于表征提取得率。
采用微量紫外测定仪和/或微量荧光剂测定提取液中的核酸质量浓度（ng/μL），结合提取液体积计算提取量，计算得率。
经验参考值：
对于几种常见的生物样本，合格的核酸提取纯化方法的参考得率（最低标准）为：
起始样品为100μL全血时，提取到的基因组DNA产量≥1μg，总RNA产量≥500ng；
起始样品为1×106细胞时，提取到的基因组DNA产量≥1μg，总RNA产量≥500ng；
起始样品为100mg新鲜植物叶片时，提取到的基因组DNA产量≥1μg，总RNA产量≥500ng。
3 核酸纯度
核酸纯度是指核酸提取物中目标核酸的纯度，该指标用于表征核酸提取物中目标核酸与残留杂质的相对含量，对于后续的分子生物学试验有重要的影响。
评价参数包括DNA纯度和RNA纯度。
核酸在特定波长的吸光度值及其在不同波长吸光度值的比率对不同性质的核酸有对应的特征值，用以表征提取液的核酸纯度。用紫外分光光度计测定260nm、280nm、230nm下提取液的吸光度OD260、OD280、OD230，计算OD260/OD280和OD260/OD230，表征核酸纯度。测量吸光度时，需调整核酸浓度，保证核酸吸光值OD260在0.1~1.5之间。
DNA纯度：纯DNA OD260/OD280为1.8，在DNA提取获得的产物中，OD260/OD280在1.7~1.9表明DNA纯度符合后续一般分子生物学试验需要。OD260/OD280>1.9时表明有RNA污染；OD260/OD280<1.7时表明有蛋白质、多酚等污染。纯DNA OD260/OD230>2.0，OD260/OD230<2.0，表明有残存的盐或其他小分子杂质。
RNA纯度：纯RNA的OD260/OD280为2.0，RNA提取溶液的OD260/OD280在1.7~2.0表明RNA纯度基本可以满足后续分子生物学试验处理需要。OD260/OD280<1.7时表明有蛋白质或多酚污染；OD260/OD280>2.0时表明可能有异硫氰酸残存。纯RNA的OD260/OD230>2.0，OD260/OD230<2.0，表明有残存的盐或其他小分子杂质。
注意事项
综上，在核酸提取实验中有以下注意事项：
一是保证核酸分子一级结构（序列）的完整性。
在核酸提取时应尽量防止物理（剪切力、高温）、化学因素（强酸、强碱）和生物因素（核酸酶）的破坏。
而核酸容易断裂，操作过程中稍有不慎就会出现核酸断裂或流失，从而影响核酸一级结构的完整性，若核酸完整性较差，可能导致下游实验出现假阴性结果。
另在提取RNA时，需注意控制RNA酶的活性。玻璃器皿、操作人员的手上以及毛发、被污染的试剂均有可能存在RNA酶，必须小心、谨慎操作，避免RNA酶将核酸降解。
二是避免污染。
包括排除其它分子污染（蛋白质、多糖及RNA等）、操作人员对样品的污染以及样品间的交叉污染。如果出现样品污染，可能导致下游实验出现假阳性结果。
三是保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。
参考资料：
1.车立忱.影响PCR实验技术因素的分析与探讨[J].中国动物保健, 2014, 16(1):3.DOI:10.3969/j.issn.1008-4754.2014.01.010.
2.中华人民共和国国家标准GB/T 37874-2019：核酸提取纯化方法评价通则.
