mRNA疗法利用细胞自身的蛋白质合成机制，相较于传统蛋白质药物，展现出了更为精简的研发流程，成为了一种前沿且创新的治疗模式。在COVID-19全球大流行的背景下，基于mRNA技术的疫苗取得了突破性进展，这一里程碑事件极大地推动了mRNA疗法的热度，特别是在病毒与肿瘤疫苗的研发领域。然而尽管前景广阔，mRNA在稳定性及免疫原性方面仍面临着许多技术挑战。
circRNA是一类由共价键形成单链闭合的环状的RNA分子。首先，因其缺乏游离末端，不易被核酸外切酶降解，而具有稳定性。其次，经过纯化的工程化circRNA在体内表现出较低的免疫原性和副作用，体现其作为药物的安全性优势。此外，circRNA的合成无需加帽、加尾等结构，也无需引入RNA修饰，便于成本控制。与线性mRNA相比，具有闭环结构的circRNA由于其优异的稳定性、低免疫原性和持续的表达而成为有吸引力的替代方案。
circRNA是如何被发现的？
图1. circRNA研究的里程碑事件[1]
1976年Hsu MT等人通过电子显微镜的观察,首次在真核细胞中发现了circRNA，但当时一度被认为是细胞内mRNA错误剪接的副产物。
1993年，Capel等发现小鼠Sry（sex-determiningregionY）基因的circRNA可能在小鼠睾丸发挥特定功能，circRNA由此真正进入科学研究领域的视野，并逐渐成为研究焦点。
2012年，Salzman等通过对多种正常和恶性人类细胞RNA的深度测序，发现数百个基因的剪接转录本的很大一部分是circRNA。证明circRNA并不是RNA剪接异常的错误，而是人类细胞中基因表达程序的普遍特征。这一发现重新激发了人们对 circRNA 研究的极大兴趣，相关研究呈指数级增长。
2018年7月是circRNA发展史上的一个关键转折点，麻省理工学院的Daniel Anderson等人，首次证实工程化的circRNA可在真核细胞中稳定、高效表达蛋白，开创了外源circRNA在真核细胞中表达蛋白的新应用，也证明了circRNA是线性mRNA的有效替代品。多家创业公司应运而生，致力于circRNA的研究与开发。
工程化circRNA常用的环化方式有哪些？
以线性mRNA为前体，体外合成circRNA的常用思路是将两个末端连接，形成共价闭合的环状结构，这个过程可以通过化学连接、酶法连接或核酶剪接作用实现。
化学连接：由于会出现磷酸迁移会形成2'-5'-磷酸键，而非天然的3'-5'磷酸二酯键的问题，目前不是主流的体外环化方式。
酶法连接：常用于RNA环化的酶包括T4 DNA连接酶1(T4 Dnl 1)、T4 RNA连接酶1(T4 Rnl 1)和T4 RNA连接酶2(T4 Rnl 2)，都为ATP依赖性的，通过3个核苷酸转移步骤催化RNA末端5'-磷酸和3'-OH的连接，将RNA分子内两端连接则可产生circRNA，三种酶的最适连接底物类型和连接特点不同，可以根据需要连接的底物类型和是否需要夹板具体选择。
核酶剪接：应用于RNA环化最常用的核酶系统为PIE系统（I型内含子或II型内含子）。基于I型或II型内含子的自剪接功能，在镁离子和游离GTP存在下，达到剪接效应，导致内含子的环化及中间序列的连接，从而产生circRNA。
图2. PIE系统环化原理[1]
利用T4 td基因或鱼腥藻tRNALeu前体基因设计排列内含子外显子(PIE)结构，属于I型内含子环化系统，该系统结合合理的环化率提升策略（如添加同源臂序列），可实现长达5 kb序列的环化，但是不足之处在于I型内含子会保留辅助外显子序列。与I型内含子PIE系统相比，使用II型内含子不需辅助外显子序列，即可产生预期的circRNA序列，该方法的广泛适用性仍需更多研究验证。
circRNA有哪些热门应用领域？
基因编辑：基因编辑能实现碱基的精准替换，及小片段的精准插入、替换和删除。目前circRNA在CRISPR引导编辑器的应用中已有报道，利用circRNA表达CRISPR-Cas9蛋白进行基因编辑，具有相当的特异性[2]。另外，在circRNA中串联置入靶向多个位点的多个crRNA，以及靶向多个位点的RTT-PBS序列，引导基于Cas12a开发的引导编辑器（CPE）系统在人类细胞系T-rich基因组区域中已做到同时成功编辑多达四个基因[3]。
蛋白替代：利用circRNA持续长效表达功能性蛋白，有利于功能性蛋白的积累并发挥功效。已有报道，在人类多能干细胞(hPSC)中单次转染表达NEUROD1的circRNA，可诱导神经元分化[2]。此外，单剂U-LNP递送的VEGF-AcircRNA制剂长效表达和释放VEGF-A，在注射第12天观察到糖尿病小鼠创面几乎完全愈合，效果显著优于线性VEGF-A mRNA和rhVEGF蛋白[4]。
肿瘤免疫：在由 KRAS G12D突变引起自发性肿瘤模型中，GSDMDENG circRNA提高患病鼠的生存率并能持续诱导KRAS G12D肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞应答并在预防胰腺癌、肺腺癌和结肠腺癌方面效果显著[5]。
疫苗研发：编码SARS-CoV-2 Spike RBD的circRNA疫苗，能够诱导有效的中和抗体和T细胞免疫反应，在小鼠和恒河猴中提供针对变种SARS-CoV-2的强大保护作用[6]。另有研究报道，单剂量优化的寨卡病毒circRNA疫苗可改善抗原表达，在小鼠中具有有效和持久的保护作用，而不会诱导明显的登革热病毒易感效应[7]。
机制研究：随着对circRNA研究的深入，它被证实广泛存在于各种生物体中，并在癌症、心血管疾病和阿尔茨海默症等多种病理过程中起到重要作用，解密其在特定生理或病理状态下的作用机制仍是目前的重要任务。
[1] Xinjie, Chen,Yuan, Lu,Circular RNA: Biosynthesis in vitro.[J] .Front Bioeng Biotechnol, 2021, 9: 0.
