导读
病毒样颗粒（Virus Like Particles,VLP）是一种模拟病毒结构的非感染性蛋白，广泛用于疫苗开发。德克萨斯理工大学研究人员曾在Scientific Reports期刊上发表了一项题目为《Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus》的创新研究。该研究成功开发了一种VLP的多价候选疫苗，能够有效针对4种由蚊子传播的病毒性疾病，即基孔肯雅病毒（Chikungunya，CHIKV）、日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis，JEV）、黄热病毒（Yellow Fever，YFV）和寨卡病毒（Zika Virus，ZIKV）。研究人员通过在小鼠模型中测试不同组合的VLP免疫原，证实了所开发的四价VLP疫苗能够诱导产生高水平的中和抗体，为这些疾病流行地区的疫苗预防策略提供了新的可能性。
一、蚊媒病毒与多价VLP疫苗
CHIKV、JEV、YFV和ZIKV是由蚊子传播的病毒性疾病，主要通过伊蚊和库蚊等蚊媒物种传播。这些病毒在热带和亚热带地区广泛流行，临床症状相似，在不同地理区域呈现流行趋势，对公共卫生安全构成严重威胁。因此，在流行区域对最脆弱的人群进行广泛的疫苗接种是控制这些病毒的关键。目前，市场上已有针对YFV和JEV的减毒活疫苗（Live attenuated Virus，LAV），但这些疫苗使用的病毒株源自20世纪70年代，存在安全性和可获得性的限制。多价人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）疫苗的成功展示了VLP作为疫苗的安全性和有效性。
VLP作为一种疫苗平台具有多方面的优势，包括能够提供重复的抗原表位、无复制能力使得在免疫受损人群中使用安全，以及通过稳定细胞系易于生产和规模化。基于这些优势，研究人员提出了开发一种针对CHIKV、JEV、YFV和ZIKV的多价VLP疫苗的构想，旨在为这些疾病的流行区域提供更广泛的保护，以应对这些病毒在全球范围内的流行和传播。
二、构建病毒结构蛋白表达载体和VLP生成
研究人员首先设计了针对YFV、CHIKV和JEV的结构蛋白表达载体，通过利用ViPR数据库中的全基因组序列，生成以上病毒的共识序列，进行密码子优化，以此提高结构蛋白在宿主细胞中的表达效率。商业合成的密码子优化序列被克隆到pcDNA 3.1载体中，并测试了蛋白表达。如图1所示，CHIKV、JEV和YFV构建体在转染后通过荧光显微镜检测到E蛋白的表达，其中CHIKV检测到E蛋白的强表达（图1E）。而JEV和YFV同时检测到衣壳蛋白的表达（图1A,C）。ZIKV蛋白表达在过去的研究者中已进行了表征。
在成功构建结构蛋白表达载体后，研究人员分析了这些经过密码子优化的载体在VLP形成中的作用。黄病毒的衣壳蛋白裂解是由NS2B-NS3复合体介导的，该复合体形成一种活性蛋白酶，负责在内质网细胞质侧切割衣壳蛋白，这是细胞信号酶进一步加工prM所必需的。通过探索ZIKV NS2B3蛋白酶对JEV和YFV CprME的切割能力，发现共转染ZIKV NS2B3能显著促进VLP的产生。此外，ZIKV和WNV的NS2B3都能有效切割CprME，促进VLP释放。对于CHIKV，通过E1-E2抗体检测到强VLP分泌。这些结果表明，CprME表达构建体能够有效表达目标蛋白，并且Zika NS2B3的共表达能与其他黄病毒CprME一起产生含有衣壳蛋白的VLP。
图1 JEV、YFV和CHKV病毒蛋白的
表达情况以及VLP的形成和分泌
RVP是一种能够模拟原生病毒感染细胞但不具有复制能力的假病毒粒子，在研究病毒生物学尤其是病毒入侵机制方面非常有用。研究者们利用RVP系统成功为CHIKV、JEV、YFV、ZIKV生成了RVPs，这些RVPs在Vero细胞中的感染性呈现出剂量依赖性。图2展示了四种报道病毒颗粒（Reporter Virus Particle，RVP）在特定血清的作用下的中和效果，证实了RVP感染的特异性和敏感性，并且这些实验结果表明RVP检测方法能够有效地用于检测中和抗体反应。这些发现证实了RVP技术在评估疫苗候选物和抗病毒策略中的潜在应用价值。
图2 使用特定疾病的血清中和RVPs感染的效果
三、双顺反子载体的构建和VLP生产
在过去对于寨卡病毒VLP疫苗的研究中，利用了衣壳蛋白作为额外免疫原来增强疫苗的免疫原性。本文参考这种策略，通过使用双顺反子载体表达黄病毒CprME和寨卡病毒NS2B3蛋白，成功制备了含有衣壳蛋白的VLP。如图3所示，通过替换ZIKV CprME序列为JEV或YFV CprME序列，成功地在培养上清中产生了含有衣壳蛋白的JEV和YFV VLP。CHIKV VLP是通过使用含有CHIKV C-E3-E2-E1基因的双顺反子慢病毒载体来实现分泌的。研究者们通过Western blotting印迹分析检测了培养上清中的VLP。这些结果表明，双顺反子载体能够有效地在培养上清中分泌含有衣壳蛋白的VLP，为黄病毒疫苗的发展提供了一个有前景的平台。
图3 双顺反子慢病毒载体表达黄病毒
结构蛋白的生成和特性分析
四、小鼠模型的免疫原性测试
通过RVP中和实验评估了这些疫苗组合诱导的中和能力，。如图4A-D所示，在所有免疫组小鼠中均检测到高水平的中和抗体。接种单价、双价或四价CJaYZ疫苗的小鼠均能诱导产生高水平的中和抗体，单价疫苗组因接受较高剂量的单一抗原，其诱导产生的中和抗体滴度最高。相比之下，双价和四价疫苗组虽然每种抗原剂量较低，但也能激发显著的中和抗体应答，尽管其滴度略低于单价疫苗组，这些结果证实了多价疫苗策略能激活针对多种虫媒病毒的免疫保护。
图4 VLP 疫苗组合的中和效果
图5的分析进一步揭示了免疫小鼠血清中针对病毒包膜蛋白（Env）、前膜蛋白（prM）和衣壳蛋白（Capsid）的特定抗体的生成情况。其中单价疫苗组引发了最强的抗体反应，而双价和四价疫苗组的抗体滴度相对较低，与抗原剂量减少有关。此外，接种疫苗的小鼠还产生了针对病毒特定蛋白（如包膜蛋白和衣壳蛋白）的免疫应答，表明疫苗能够诱导出具有特异性的免疫反应。这些数据证实了多价VLP疫苗能诱导小鼠产生针对多种虫媒病毒的特异性免疫应答，为疫苗的进一步开发和应用提供了重要信息。
图5 VLP免疫小鼠产生的抗体反应质量
五、细胞悬浮培养和无血清培养基的适应性
为了实现VLP疫苗的高效、大规模生产，并满足商业化生产的质量和安全要求。研究人员将稳定细胞系适应于悬浮生长和无血清培养基，以实现VLP的快速、可扩展生产的过程。通过在特定的无血清培养基中培养，细胞能够在悬浮状态下生长，提高了生长密度并增加了VLP的分泌效率。适应悬浮培养的细胞通过流式细胞术分析显示E蛋白表达与贴壁细胞相当（图6A），而蛋白印迹分析表明悬浮培养的细胞在VLP分泌上更为高效（图6B）。明场显微镜观察显示悬浮细胞形态适合大规模培养（图6C）。
图6 适应稳定细胞系以适应悬浮培养物中的生长
美国德克萨斯理工大学研究人员成功开发了一种基于VLP的多价候选疫苗，该疫苗能够有效针对CHIKV、JEV、YFV和ZIKV，通过稳定细胞系分泌VLP，并在小鼠模型中诱导产生高水平的中和抗体，展示了作为多价疫苗的潜力。研究同时也证明了使用VLP作为疫苗平台的安全性和有效性。此外，研究者们还开发了针对这四种病毒的RVP检测方法，并验证了这些检测方法的敏感性和特异性。通过适应悬浮培养和无血清培养基，细胞系的VLP生产得以规模化，为疫苗的商业化生产提供了便利。
作者认为，基于上述发现，这种多价疫苗可能为控制和预防由这四种病毒引起的疾病提供一种有效的策略。这种疫苗的开发不仅能够针对单一病毒，而且能够适应不同地理区域的需要，为全球公共卫生提供了一种新的工具。此外，这种多价VLP疫苗的开发策略也可能为其他多价疫苗的研发提供参考，有助于应对其他由蚊子传播的病毒疾病。
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