荷兰人类药物中心：鼻喷流感疫苗 (FluGEM) 在成人中的临床Ⅰ期随机双盲对照递增剂量研究，探究安全性、反应原性和免疫原性

据估计，季节性流感每年在全球范围内导致约29万至65万人不幸离世。其中，5岁以下儿童与65岁以上老年人面临的流感相关严重并发症及死亡的风险更加严峻。

流感疫苗虽已问世数十年，但仍有许多挑战亟待克服。在高风险群体中激发有效且持久的疫苗诱导免疫反应，其复杂性不容小觑；幼儿的免疫系统尚显稚嫩，而老年人的免疫功能则因衰老而衰退。

当前可用的疫苗通过添加佐剂来提升其免疫原性。多数获批的季节性疫苗由三价或四价灭活流感病毒构成，通常通过肌肉注射引发全身免疫反应。自COVID-19爆发以来，呼吸道病毒鼻内疫苗再次引发广泛关注，因其粘膜免疫或许能更有效地阻断传播，从源头上遏制感染。特别是对于流感，由于抗原漂移的持续存在及与抗原转移相关的大流行威胁，亟需改进针对异源菌株交叉保护的疫苗策略。鼻内免疫引发的粘膜IgA有望提供针对异源及漂移菌株的交叉保护。

相较于传统的肌肉注射途径，鼻内疫苗接种的无针给药方式更具患者友好性，且在大规模免疫中展现出更大潜力。

目前，仅有减毒活疫苗获准用于鼻腔内给药（如Fluenz Tetra/Flumist Quadrivalent，MedImmune，美国盖瑟斯堡），但与注射流感疫苗相比，2岁以下儿童的住院及喘息发生率更高，成人中的有效性亦较低，因此其使用范围仅限于2至18岁的青少年。佐剂的加入有助于增强鼻腔内疫苗接种方法的免疫原性。肠毒素蛋白（含大肠杆菌不耐热毒素及其衍生物）虽已被证实为强效且有效的粘膜佐剂，但其具有面神经麻痹相关风险。

因此，寻找安全有效的替代粘膜疫苗佐剂刻不容缓，革兰氏阳性增强基质（GEM）或成为一种有潜力的候选佐剂。GEM佐剂由来自乳酸乳球菌的非活细菌样颗粒（BLP）构成，该乳酸菌为食品级无致病性革兰氏阳性菌，不产生内毒素，亦不在人体粘膜腔内定植。GEM由肽聚糖外表面组成。肽聚糖已知具有免疫刺激特性，并在GEM佐剂特性中扮演关键角色。小鼠研究显示，鼻内给予混合流感病毒抗原（FluGEM）的GEM安全无虞，且在一次加强剂量后引发的血凝抑制（HI）滴度与肌肉注射疫苗相当。

鼻内接种FluGEM能产生强烈的粘膜IgA反应，在同源及异源流感病毒攻击模型中均展现出完全保护性，与无佐剂流感疫苗相比，保护效果更胜一筹。

近期，荷兰人类药物中心进行了首次人体临床试验的结果，该试验的目的是评估健康成人和老年人（65 岁及以上）鼻内接种 FluGEM 疫苗的安全性、耐受性、反应原性和免疫原性。结果发表于Vaccine期刊。

doi:10.1016/j.vaccine.2024.03.063

这是一项首次在人体中进行的随机、双盲、对照、剂量递增研究，在荷兰人类药物研究中心 (CHDR) 进行。18-49 岁的参与者按3:1的比例随机接受递增剂量的 FluGem®（两剂方案）以及标准三价灭活流感疫苗或仅无佐剂TIV。

图 1. 简化研究计划 SCR = 筛选

在筛选时（研究开始前 7 天）或基线时（第 0 天），在第一次接种疫苗前和第二次接种疫苗前 21 天采集血液样本，用于评估血凝素抑制 (HI) 滴度。最后在第 210 ± 15 天采集最终血液样本，用于评估抗体的持久性。

在筛选时、第 21 天（第二次接种疫苗前）、第 42 天和第 210 ± 15 天采集鼻冲洗液，用于测定 IgA。在整个随访期间评估安全性，直至第 210 天。每次接种疫苗后 7 天内记录征求的不良事件。

主要结果：安全性和耐受性。

次要结果：血清血凝抑制 (HI) 抗体滴度和粘膜 IgA。在另一组老年人（>65 岁）中使用了最具免疫原性的剂量。

该研究从 2011 年持续到 2012 年。初始 18-49 岁年龄组共纳入 60 名符合条件的受试者。除 3 名受试者外，所有受试者均完成了两剂 FluGEM 或 TIV 治疗方案。

随后，纳入 30 名老年受试者，接受选定剂量的 1.25 mg FluGEM（n = 15）或仅接受 TIV 作为对照组（n = 15）。在老年组中，对照组的女性受试者略多于 FluGEM 组（33.3%）。所有老年受试者均接受了 2 次鼻内给药 FluGEM 或对照治疗。

表1 基线特征

所有剂量的 FluGEM 均耐受性良好，在第二次接种 FluGEM 后没有出现反应原性增加的迹象。

所有 FluGEM 组 (86.7-100%) 中报告 ≥ 1 次治疗出现的不良事件（主动或被动）的受试者百分比相当，对照组 (93.3%) 也类似。绝大多数不良事件为轻度 (97.4%)，1.25 mg 组有两例中度流感样疾病，属于自限性。

两名受试者出现严重不良事件：一名受试者在发生与疫苗无关的创伤后出现脑震荡，另一名受试者在第一次接种疫苗 6 天后（1.25 mg 组）食用泰国菜后不久出现过敏反应。根据协议暂停规则，该受试者因间歇性严重不良事件而未接受第二次接种，并被退出。

频次最高的未报告不良事件是呼吸道不适，其中最常见的是喉咙刺激（活性组 22%；对照组 27%）。如果受试者报告呼吸道不适，则大多在接种疫苗后 48 小时内报告，但活性组和对照组这些不良事件发生的时间相当（活性组 55% 至 65% 的呼吸道不良事件报告时间 < 48 小时，对照组为 60%）。对照组、1.25 mg 和 2.5 mg 组均报告鼻出血发生率较低（6.7%-13.3%），但在最高 5.0 mg 剂量组无此情况，表明无明显的剂量相关效应。

研究中未观察到严重不良事件 (SAE)。

另外，不良事件（接种疫苗后 7 天内发生）发生率并未随着 FluGEM 剂量的增加而增加（表 2）。FluGEM 给药后诱发不良事件的发生频率与对照组相当，对照组和 2.5 mg组报告的头痛最为常见（67%）。没有剂量限制性毒性或神经毒性的迹象。在血液化学、血液学和尿液分析评估中未观察到临床关注的发现。

表2 收集的局部和全身不良事件

老年组治疗中出现的不良事件发生率与 18-49 岁年龄组 (86.7%) 相当，不良事件的性质也相当。

FluGEM (1.25 mg) 剂量组发生了两起无关的 SAE：一名受试者 (年龄：67 岁) 发生心肌梗死 (第二次接种疫苗后 8 天)，由于动脉粥样硬化需要经皮冠状动脉介入治疗并植入支架；另一名受试者 (年龄：67 岁) 出现窦房结功能障碍 (第二次接种疫苗后 3 个月)，需要植入起搏器。老年组报告的所有其他不良事件均为轻微，除了一例与疫苗接种无关的中度胃肠炎。

FluGEM 组患者自发的局部和全身不良事件在性质和发生频率上与对照组相似。值得注意的是，与 18-49 岁人群相比，老年组患者打喷嚏的频率更高（对照组和 FluGEM 1.25 mg 组分别为 60% 和 73.3%）。总体而言，65 岁及以上人群对 FluGEM 的耐受性良好。

针对乙型流感病毒、H1N1和 H3N2的基线（启动接种当天）HI滴度在 18-49 岁年龄组中的各治疗组中分布广泛。基线血清阴性率（HI 滴度 < 1:40）因毒株而异，各剂量组的百分比相当（范围：80-93 % [B]、53-67 % [H1N1] 和 60-73 % [H3N2]）。

与对照组相比，1.25 mg 和 2.5 mg 剂量的 FluGEM 对 B 型毒株和 H1N1 型毒株的 HI 滴度增加更快且幅度更大（表 3）。

表3 在所有时间点有数据的受试者的血凝素抑制几何平均滴度和与基线滴度的比率

GMR = 几何平均滴度与基线之比；GMT = 几何平均滴度；HI = 血凝抑制；TIV = 三价灭活流感疫苗。

所有治疗组在接种三种流感病毒株后 GMT 倍数均增加 ≥ 2.5（表 3）。对于 B 株，在接种 1.25 mg 和 2.5 mg FluGEM 后 GMR 最高（约为对照组 GMR 的 2 倍）。对于 H1N1 株，接种 FluGEM 后第 21 天和第 42 天的 GMR 增幅与对照组相当。然而，B 株和 A/H1N1 株 1.25 mg 和 2.5 mg FluGEM 剂量组在第 210 天的 GMR 明显较高（B 株和 A/H1N1 株的 GMR 分别为 7.7 和 5.7 [1.25 mg] 和 8.8 和 4.9 [2.5 mg]，而对照组为 4.8 和 3.9 [对照组]）。所有制剂（包括无佐剂对照组）均对 H3N2 毒株表现出非常强烈的 HI 反应。与无佐剂对照组相比，在研究的时间点，FluGEM 佐剂剂量并未引起 A/H3N2 毒株更高的 GMR。

在全研究组中，1.25 mg 剂量组在第 21 天（单剂量）和第 42 天（双剂量）所有测试菌株的血清转化率均达到 ≥ 40 %，而 2.5 mg 剂量组在第 42 天（双剂量）仅达到此标准（表 4）。非佐剂对照组仅对 H3N2 菌株满足此标准。血清阴性受试者的血清转化率较高。在血清阴性亚群中，1.25 mg 和 2.5 mg（但 5 mg 组除外）和非佐剂对照组所有菌株的血清转化率均达到 ≥ 40 %

表4 血清转化率，18-49 岁

TIV=三价灭活流感疫苗。

甲型流感病毒株（H1N1 和 H3N2）的血清保护率最高，所有治疗组的保护率均达到 ≥ 70%（表 5）。B 型流感病毒株的血清保护率最高，剂量为 1.25 mg FluGEM，第 21 天血清保护率为 73%，第 42 天血清保护率为 64.3%。基线血清阴性的受试者的血清保护率始终较低。

表5 18-49 岁血清保护率

TIV=三价灭活流感疫苗

在对照组 2.5 mg 和 5 mg FluGEM 组中，大多数受试者的接种前 IgA 滴度低于检测限（每组 >73% 的受试者）。然而，在 1.25 mg 剂量组中，只有 6 名受试者的 IgA 低于此限值（表 6）。

所有组在接种疫苗后均显示鼻腔 IgA 水平升高。

在第 21 天，1.25 mg FluGEM 剂量组的 IgA GMR 最高（比率：1.8）。这种影响在基线时 IgA 水平未检测到的受试者中更为明显（GMR：第 21 天和第 42 天分别为 3.7 和 3.2）。在其他剂量组中未观察到低预先存在的 IgA 水平对 GMR 的这种影响。在第 210 天，所有治疗组的 IgA 均恢复到基线水平。

表6 在所有时间点有数据的受试者的鼻腔 IgA 滴度

GMR = 与基线的几何平均滴度比；GMT = 几何平均滴度；TIV = 三价灭活流感疫苗

血清中总流感病毒特异性 HA IgG 以及 IgG1 和 IgG3 亚类列于表7。

所有治疗组在接种疫苗后均表现出 IgG1 主导反应，其中 1.25 mg 剂量组的 IgG1/IgG3 比率最高（未显示数据）。

表7 在所有时间点有数据的受试者的流感特异性 IgG、IgG1 和 IgG3 亚类

TIV = 三价灭活流感疫苗

在对18-49岁人群中先前剂量水平的安全性和免疫原性数据进行中期分析后，SMC决定选择1.25 mg剂量对老年受试者进行评估，因为该剂量在总体上表现出最佳的免疫原性。

总体而言，无佐剂灭活三价疫苗（对照组）和1.25 mg FluGEM的全身免疫原性均未如18-49岁组那么明显。对照组和1.25 mg FluGEM的血清转化率和保护率相似。两个剂量组均未达到40%血清转化和70%血清保护的标准。

在基线日，对照组中IgA滴度低于检测下限的受试者（93%）多于1.25 mg FluGEM组（64%），两者存在显著差异。在≥65岁的受试者中，未观察到对鼻腔IgA GMT和比率的显著治疗效果。

本研究中，FluGEM[含革兰氏阳性基质（GEM）颗粒佐剂的三价灭活流感疫苗]首次通过鼻腔内接种途径应用于人体。结果显示，所有探索的鼻腔内剂量（18-49岁组最高5mg，老年人最高1.25mg）均展现出良好的耐受性。接种FluGEM疫苗后不良事件的发生频率与强度与未加佐剂的TIV相当。

在18-49岁年龄组中，相较于未加佐剂的TIV，FluGEM对体液全身免疫反应产生了积极影响，特别是1.25mg和2.5mg剂量水平对多种流感病毒株产生了最高的血凝抑制（HI）滴度。通过多个血清学保护参数评估疫苗的免疫原性，发现所有治疗组（包括对照组）的几何平均滴度（GMT）均增加≥2.5倍；而在1.25mgFluGEM组中，仅一次剂量后即可实现所有菌株的血清转化（≥40%）。2.5mgFluGEM组同样实现了对所有菌株的血清转化，但需两次剂量。仅在2.5mg剂量（仅第21天）中观察到所有菌株的血清保护（≥70%）。从历史数据来看，每年接种季节性灭活疫苗应满足这些标准中的三分之一。

与未加佐剂的鼻内三价疫苗（对照组）相比，FluGEM剂量在血清转化和血清保护标准方面表现更优，表明FluGEM对这些终点具有潜在的佐剂作用。此外，当将第210天的HI GMT比率与对照组进行比较时，FluGEM似乎对B和H1N1毒株（但对H3N2毒株无显著影响）引发了更持久的全身体液反应。

FluGEM 对粘膜 IgA 之佐剂效应，于 1.25 mg 剂量组（无预存鼻腔 IgA 滴度）中尤为显著，IgA 滴度于首次接种后达至峰值（GMT 比率：3.7）。虽粘膜 IgA 保护作用之确切关联，尤针对当前流行之流感病毒株，尚待明晰，然本研究中 IgA 反应的幅度（IgA 增加之倍数），与先前流感病毒人体攻击研究中被视为具保护作用之 IgA 水平，或相当或更胜。

研究发现，在18-49 岁人群中，1.25 mg及2.5mg的FluGEM 鼻内剂量，相较最高剂量 5 mg，更具免疫原性。首次人体研究中，SynGEM 乃基于相同细菌样颗粒平台之鼻内候选疫苗，以重组呼吸道合胞病毒 (RSV) F 蛋白为主要抗原，附着于 BLP——与高剂量方案相较，低剂量组加强接种后血清 IgG 滴度更显优势。

相较其他终点，较高剂量似更具免疫原性。据推测，GEM佐剂的作用机制，或经由 toll 样受体 (TLR)-2 信号传导。虽然TLR2 激活常显现剂量依赖性下游效应，然部分 TLR2 激动剂之剂量反应关系，已描述为非线性的“钟形”。FluGEM 剂量反应关系之确切免疫学基础，尚待揭晓，未来研究将予探寻。

鼻腔内给予FluGEM在老年受试者（≥65岁）中表现出良好的耐受性。然而，与18-49岁人群相比，1.25mg的剂量在老年人中的免疫效果并不显著。老年人群的粘膜免疫仍然是粘膜疫苗开发中一个众所周知的挑战，这可能与免疫衰老有关。动物研究数据显示，鼻腔IgA免疫反应可能会因年龄相关的免疫系统衰退而减弱。

即使在控制人类呼吸道病毒感染后，老年人群的鼻腔IgA产生也可能存在缺陷。此外，与年龄相关的鼻腔解剖变化（如粘膜萎缩和鼻腔增大），也可能对鼻腔内疫苗的充分给药构成挑战。为优化老年人群的免疫效果，可以进行进一步的剂量探索，并考虑优化疫苗配方，例如使用粘膜粘附剂以延长疫苗的停留时间并增加活性化合物的吸收，或者探索新的递送系统以提高这一特定人群的免疫原性。