导读
基因工程最重要的分支之一是利用生物表达系统表达重组蛋白。酵母表达系统如酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae，S. cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia Pastoris，P. pastoris）更为常用，其中毕赤酵母表达系统是分子生物学中生产重组蛋白最受欢迎和标准的工具之一。尽管毕赤酵母表达系统易于使用且具有明确的工艺规程，但仍需要工艺优化以实现目标蛋白的最大产量。
在Journal of Cellular Physiologys发表题目为《Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins》的文章，介绍了毕赤酵母作为重组蛋白表达系统的特点、优势、应用及优化策略，展示其在分子生物学和生物技术中的重要性与潜力，为相关研究与应用提供全面参考。
一、 毕赤酵母表达系统
随着生物技术发展，生物表达系统用于生产异源蛋白。原核表达系统如大肠杆菌存在蛋白折叠、修饰及降解等问题；哺乳动物表达系统虽具正确折叠和修饰能力，但生长慢、成本高且易受病毒污染。酵母表达系统因兼具原核与真核优势而备受关注，毕赤酵母表达系统更是其中的佼佼者。毕赤酵母最初从法国栗树渗出物分离，能够以甲醇作为唯一的碳源和能源。其中毕赤酵母GS115用表达系统，含AOX1和AOX2基因，但AOX1产生的酶更多。因此可通过敲除AOX1基因来影响菌株甲醇利用能力，使甲醇上的生长速度会大幅减慢，这种表型被称为甲醇利用缓慢（Mut⁵）。敲除AOX2基因不会减缓在甲醇上的生长，其生长速率与甲醇利用阳性（Mut+）表型相当。通过敲除这两个基因，菌株无法在甲醇上生长，即甲醇利用阴性（Mut⁻）。
二、毕赤酵母表达系统的特征
毕赤酵母表达系统的优缺点
毕赤酵母表达系统成本低廉，表达时间相对较快，具有共翻译和翻译后加工能力并且能够进行翻译后修饰。酵母细胞中有两种主要的糖基化类型（N-连接和O-连接糖基化），N-连接聚糖的结构通常是高甘露糖型，酿酒酵母中的N-糖基化以高甘露糖基化为特征，具有α -1,2 -、α -1,6 -和α -1,3-甘露糖基转移酶（图1b）。与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会过度糖基化治疗性蛋白质，也不含潜在免疫原性的末端α -1,3 -连接的甘露糖（图1c）。另外毕赤酵母可用于生产治疗性糖蛋白，N-糖基化在实现治疗性蛋白质的完整生物活性方面起着重要作用（图1a）。
毕赤酵母表达系统在转化阶段感受态细胞需要大量质粒，该系统中重组蛋白的生产由两个启动子调控：甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（PGAP）和醇氧化酶启动子（PAOX1）[1]。但重组蛋白的表达至少需要0.5%的甲醇浓度，甲醇的产量最高可达到2-2.5%（w/v）。另外毕赤酵母系统用于转化的可选标记较少，常见的是表达培养液被腐生细菌和真菌污染。这些微生物分泌的蛋白酶可能将分泌的蛋白质水解到上清液中对产生的蛋白质的破坏。
图1哺乳动物细胞、酿酒酵母
和毕赤酵母中N-连接聚糖结构示意图
毕赤酵母表达系统的克隆与表达
毕赤酵母中任何重组基因的表达都有三个阶段：（a）将新基因克隆到合适的表达载体中；（b）将克隆的载体插入毕赤酵母宿主基因组；（c）测试不同菌株表达重组整合基因的潜力。首先克隆的载体应使用限制性内切酶进行线性化，然后线性DNA通过电穿孔法插入感受态细胞中，进入的基因通过同源重组现象整合到细胞基因组中（图2），从而形成重组细胞。在大多数情况下，基因组中发生单次交叉，但在1-10%的情况下会发生多次插入。
图2毕赤酵母基因组中的交叉重组现象
表达载体是毕赤酵母表达系统的重要组成部分。由启动子序列（AOX1）、转录终止序列以及一个包含克隆位点的序列构成。毕赤酵母中的表达载体是穿梭载体，即它们可以在两种不同的宿主物种中繁殖，且包含耐药基因。毕赤酵母表达系统中用于生产胞外和胞内蛋白质的常用质粒分别列于表1和表2中。
表1 用于生产分泌蛋白的常见毕赤酵母表达载体
表2 用于生产胞内蛋白的常见毕赤酵母表达载体
毕赤酵母中表达的亚单位疫苗
亚单位疫苗由病原体的免疫优势抗原组成，安全且成本效益高。毕赤酵母甘露糖基化的抗原具有增强的抗原呈递和T细胞活化特性，T细胞活化在诱导保护性免疫反应中至关重要[2]。在毕赤酵母系统中表达的一些新的重组亚单位疫苗列于表3中。
表3 毕赤酵母表达的重组亚单位疫苗
三、提高毕赤酵母中蛋白质表达的策略
在发酵过程中监测甲醇水平可使细胞生长并优化生产力。根据甲醇的利用情况毕赤酵母菌株分为三种表型：Mut⁺菌株（同时具有AOX1和AOX2基因）、Mut⁵菌株（仅具有AOX2基因）、Mut⁻突变菌株（不具有任何AOX基因）。因此，不同菌株的生长速率取决于其Mut表型。Mut⁺菌株每小时的生长速率范围较宽，而Mut⁵菌株的生长速率范围较窄。另一方面低浓度的甲醇会引发重组蛋白的蛋白水解降解，导致生产力降低。山梨醇在毕赤酵母表达系统中可与甲醇混和使用不会诱导或抑制AOX启动子，因此使用山梨醇可以降低细胞生长速率、提高特定产物形成速率、提高生产力和细胞密度并缩短诱导时间[3]。另外毕赤酵母所需的生长温度为28-30°C，将培养温度从30°C降低到20°C，低温培养中目标蛋白合成速率降低导致内质网应激减少，保留了内质网的折叠能力并提高了细胞活力。在毕赤酵母表达系统中，生产时间相对较长（约100小时），培养时间与酵母细胞数量和目标蛋白降解程度有关。研究表明较长的培养时间很可能会导致表达的蛋白质更多地被蛋白水解消化。此外其他研究讨论了在72至96小时培养时间内发生最佳蛋白质表达。
毕赤酵母表达系统在重组蛋白生产方面具有重要地位，尽管存在一些局限性，但通过优化甲醇和山梨醇浓度、Mut 形式、温度和孵育时间等条件，可提高目标蛋白的产量。毕赤酵母在亚单位疫苗和其他生物分子生产中的应用也显示出其巨大的潜力，为生物制药和工业生物技术的发展提供了有力支持。未来，随着研究的不断深入，毕赤酵母表达系统有望在更多领域得到更广泛的应用。
参考文献
[1]Offei B , Braun-Galleani S , Venkatesh A ,et al.Identification of genetic variants of the industrial yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris) that contribute to increased yields of secreted heterologous proteins[J].PLoS biology, 2022, 20(12):e3001877.
[2]Akansha Shrivastava, Mamta Pal, Rakesh Kumar Sharma,Pichia as yeast cell factory for production of industrially important bio-products: Current trends, challenges, and future prospects,Journal of Bioresources and Bioproducts,Volume 8, Issue 2,2023,Pages 108-124.
[3]Wollborn, D., Munkler, L.P., Horstmann, R.et al.Predicting high recombinant protein producer strains of Pichia pastoris MutS using the oxygen transfer rate as an indicator of metabolic burden.Sci Rep 12, 11225 (2022).
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