苏州大学潘向强/海军军医大学长海医院高洁/牡丹江医科大学武艳：开发ROS敏感阳离子纳米凝胶，为肿瘤治疗提供新策略

近期，苏州大学潘向强研究员、海军军医大学第一附属医院高洁研究员与牡丹江医科大学武艳副院长合作团队在Bioactive Materials上发表了题为“ROS‑Sensitive PD‑L1 siRNA Cationic Selenide Nanogels for Self‑inhibition of Autophagy and Prevention of Immune Escape”的研究论文((Bioactive Materials 41 (2024) 597‑610)。该研究开发了一种新型ROS敏感性阳离子交联聚合物递送siPD‑L1的纳米凝胶，通过抑制肿瘤自噬上调MHC‑I，同时下调PD‑L1表达，有效阻止肿瘤免疫逃逸。

癌症作为全球主要的健康负担之一，其治疗策略的创新与突破一直是医学研究的热点。自噬抑制作为一种新兴的肿瘤治疗手段，虽然在理论上具有广阔的应用前景，但在临床应用中却面临着诸多挑战。特别是自噬抑制后肿瘤细胞PD‑L1的上调，导致肿瘤细胞能够逃避免疫系统的监视，这严重限制了自噬抑制治疗策略的疗效。潘向强研究员，高洁研究员与武艳副院长团队的这项研究，创新性地将ROS敏感的阳离子纳米凝胶与PD‑L1 siRNA相结合，成功解决了上述难题。

如图1所示，作者利用硒醇点击化学介导的多组分反应(MCR)技术开发出了生物相容性好，具有 ROS 响应性和质子海绵效应的阳离子聚乙烯亚胺(PEI)纳米凝胶。低分子量聚乙烯亚胺(LMW PEI)、γ‑硒代丁内酯(γ‑SBL)和聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)经一锅法反应制备得到二硒醚动态交联水凝胶；利用其动态响应性，在低浓度下经过超声转变为纳米凝胶，进而构建了一个二硒醚交联阳离子纳米凝胶库(A_xSe_yO_z)。高通量筛选优化得到A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1纳米凝胶复合物，其尺寸均一(平均粒径141 nm)，具有卓越的胶体稳定性以及高效的PD-L1沉默效果，可实现在氧化还原刺激条件下的siRNA按需释放；在功能验证方面，A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1纳米凝胶显著提升了肿瘤细胞的吞噬效率，并展现了优异的氧化降解性能。该纳米凝胶，通过促进溶酶体内pH值的升高，抑制自噬并上调MHC‑I表达；通过递送PD‑L1 siRNA，显著降低因自噬抑制而加剧的肿瘤细胞表面PD‑L1高水平表达，进而显著促进了特异性CD8+ T细胞的增殖和活化，有效减缓了MC38肿瘤模型生长。

一、 多组分反应 (MCR) 制备 A_xSe_yO_z纳米凝胶及转染效率筛选

为了创建高效的 siRNA 递送平台，作者开发了一种硒醇点击化学介导的多组分反应 (MCR)，偶联 LMW‑PEI、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯 (PEGMA) 和 γ‑硒丁内酯 (SBL)，一锅反应制备得到二硒醚动态交联水凝胶；利用其动态响应性，在低浓度下经过超声转变为纳米凝胶，进而构建了一个二硒醚交联阳离子纳米凝胶库(A_xSe_yO_z)(图2)。以 A_xSe_yO_z 作为载体，通过组合化学高通量筛选策略优化A_xSe_yO_z /siPD‑L1纳米凝胶复合物，筛选过程包括粒径评估、凝胶阻滞和基因沉默效率，并根据纳米颗粒的尺寸、转染效率、毒性和稳定性确定最佳配方(图3)。

二、A_1.8Se₃O_0.5/siPD-L1通过碱性溶酶体抑制自噬，并上调MHC-1的表达

研究显示，A_1.8Se₃O_0.5/siRNA 纳米凝胶能有效进入肿瘤细胞，诱导溶酶体碱化，抑制自噬，并上调 MHC‑I 的表达。此外，纳米凝胶还能通过诱导溶酶体碱化抑制自噬通量，具体表现为自噬体的积累增加，自溶酶体的积累减少。值得注意的是，A_1.8Se₃O_0.5/siRNA 纳米凝胶能够恢复肿瘤细胞中 MHC‑I 的表达。这一点尤为重要，因为肿瘤细胞通常会出现 MHC‑I 表达减少的情况，从而影响抗原呈递和免疫识别。纳米凝胶对 MHC‑I 表达的恢复表明，它们具有增强抗原递呈和改善针对肿瘤的免疫反应的潜力(图4)。

三、A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1有效下调PD‑L1的表达，激活T细胞

研究还揭示了PD‑L1与自噬之间的联系，阐明了自噬阻断如何上调PD‑L1的表达。通过将PD‑L1 siRNA整合到A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1纳米凝胶中，有效地实现了PD‑L1的下调，并展示了较高的内体逃逸效率。此外，实验结果表明，A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1处理可诱导 T 细胞活化，这表明它具有增强抗肿瘤免疫反应的潜力(图5)。此纳米凝胶有望成为对抗免疫抑制和增强抗肿瘤免疫的治疗方法，有必要进一步研究评估 A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1的体内疗效和安全性，使其更接近于开发出针对PD‑L1和自噬的创新免疫治疗策略来治疗癌症。

四、A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1的组织分布和抗肿瘤活性

在MC38肿瘤小鼠模型中，A_1.8Se₃O_0.5/Cy5.5 siRNA 能在肿瘤部位蓄积。此外，A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1 还能显著抑制肿瘤生长。研究结果凸显了 A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1 在靶向给药方面的潜力，以及作为增强抗肿瘤免疫反应的一种有前途的策略(图6)。

五、体内抗肿瘤机制

多色免疫荧光系统来同时监测各种免疫细胞群的变化，对信号强度的定量分析显示，不同处理的肿瘤的免疫细胞数量存在显著差异。值得注意的是， A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1处理的肿瘤显示出 T 细胞和 Granzyme B 数量的整体增加(图7)，在肿瘤引流淋巴结(TDLNs)中，A_1.8Se₃O_0.5治疗增加了CD11c+CD80⁺和CD11c+CD86+ DCs的百分比，表明TDLNs中基于DC的免疫反应更强。在肿瘤微环境中，A1.8Se3O0.5/siPD-L1 处理增加了 CD4+ 和 CD8+T 细胞的频率，尤其是 CD8+ T 细胞，表明  A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1 增强了抗肿瘤活性。A_1.8Se₃O_0.5/siNC通过破坏溶酶体功能和恢复MHC‑I表达来抑制自噬，而 A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1不仅能恢复MHC‑I表达，还能有效抑制PD‑L1表达，从而通过有效促进DC成熟和招募CD8+T细胞来有效防止免疫逃逸(图8)。

综上，该团队成功开发了一种高效的硒醇点击化学介导的组合化学策略，用于制备递送 siRNA 的二硒醚交联阳离子纳米凝胶库，并通过高通量筛选优化得到A_1.8Se₃O_0.5/siPD‑L1纳米凝胶复合物用于肿瘤治疗。该复合物增强了肿瘤细胞的内化能力，表现出卓越的氧化还原刺激响应性，并能通过溶酶体碱化抑制自噬。重要的是，其显著降低了 PD‑L1 的表达，提高了MHC‑I的水平，从而增强了特异性 CD8+ T 细胞的增殖，减缓了 MC38 肿瘤的生长，展现出同时抑制自噬和防止免疫逃避的协同抗肿瘤功效。本研究发展的简便、可推广的硒醇点击化学多组分反应功能化方法可扩展到具有伯胺、仲胺和叔胺基团的各种化合物，为开发基于阳离子纳米递送系统的基因疗法开辟新途径。总的来说，这项研究不仅提供了一种新的癌症治疗策略，而且为自噬抑制与肿瘤免疫逃逸的联合干预提供了实验依据。

潘向强 研究员

博士，研究员; 2011 年获苏州大学有机化学专业博士学位，2011 年 7 月至今，苏州大学高分子科学与工程系博士后工作，同年留校任教。主持国家自然科学基金项目 3 项，其他省部级项目 5 项。在 Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Sci.、ACS Macro Lett.、Macromolecules、Biomacromolecules、ACS Energy Lett.等国际期刊上发表论文100余篇，申请专利10余件。获得各级奖励4项，其中获中国化工学会基础研究成果奖一等奖1项（2021）。长期从事可控自由基聚合理论研究，基于有机硒化学的高性能聚合物设计合成，以及智能响应聚合物的应用研究。

高洁 研究员

研究员、博导和独立课题组长，上海市航海医学与药械转化重点实验室副主任，美国密歇根大学安娜堡分校药剂学系和生物工程系访问学者，就职于上海长海医院临床研究中心，研究方向：基于纳米材料的肿瘤防治和器官保护。以通讯和第一在Adv. Sci.等期刊发表SCI论文100篇，38篇>10，总IF：865，引用次数>4000次，H指数36，i10指数72，ESI高被引4篇，封面论文8篇。主持11项国家和省部级基金（含3项面上），10项授权专利，第一主编《生物医用材料：组织修复与肿瘤治疗》（30万字，上海交大出版社）。担任中国研究型医院学会神经损伤修复材料研究学组副组长、上海市药学会药剂专委会委员以及6个学术期刊编委或青年编委，包括Asian J Pharm Sci, Exploration, View和中国肿瘤生物治疗杂志等，并荣获上海市"青年科技启明星"、"晨光学者"称号，以及上海市自然科学奖二等奖等荣誉。

武艳 副教授

博士，副教授，硕士生导师，现任牡丹江医科大学生命科学学院副院长/医药研究中心副主任，生物材料教研室副主任。美国哥伦比亚大学访问学者，黑龙江省细胞生物学省级领军人才梯队后备带头人，黑龙江省生物化学与分子生物学学会理事，中国生物医学工程高级会员。长期从事基于生物材料的组织损伤修复与再生研究工作，通过综合应用生物学、医学、材料学以及工程学等多学科交叉领域的理论和技术手段，聚焦临床上组织损伤修复领域的关键科学问题展开研究工作。主持国家自然科学基金、省自然科学基金、省教育厅、省卫生厅等多项基金，在 Bioact. Mater.、Chem. Engi. J.、Biomater. Res.等有科研前沿影响力的杂志上发表论文24篇（第一作者或通讯作者）。主编论著一部。获得省部级科研奖励2项，厅局级科研奖励7项。获得国家发明专利3项。

本课题资助基金如下：国家自然科学基金项目(No. 21971177, 82072051)、江苏省高等学校自然科学基金项目(No. 22KJA150004)、江苏省高等学校重点学科建设项目(PAPD)、苏州大学江苏省先进功能聚合物设计与应用重点实验室、苏州大学国家自然科学基金项目苏州大分子设计与精密合成重点实验室、苏州大学创新科研团队计划。

Jie Gao, et al., ROS-sensitive PD-L1 siRNA cationic selenide nanogels for self-inhibition of autophagy and prevention of immune escape. Bioactive Materials, 41 (2024) 597-610. 

DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.08.013