骨骼肌再生用湿组织粘接聚合物粉末水凝胶

体积性肌肉损失通常由创伤事件引起，并可导致严重的功能残疾。由于组织-水凝胶界面处的水化层，传统的黏合剂水凝胶在潮湿、出血的伤口中表现出较差的组织粘附性，导致性能不足。在这项研究中，我们开发了一种新型的，由葡聚糖醛和明胶组成的湿组织粘合剂粉末水凝胶。该粉末吸收组织上的界面组织液和缓冲溶液，自发形成水凝胶，并通过各种分子相互作用，包括希夫碱反应，强力粘附在组织上。我们的湿粘粉末水凝胶可以作为修复各种组织的有效平台，包括心脏，肌肉和神经组织。

引言

骨骼肌约占体重的30-40%，主要负责身体运动和产生力量。骨骼肌经常受到不同程度的创伤损伤。创伤性事件常导致体积性肌肉损失(VML)，骨骼肌总量损失大于20%，导致不可逆的肌肉损失、功能受损和长期残疾。目前临床治疗VML的标准是自体肌瓣移植，然而，它有几个严重的缺点，包括复杂的外科手术，有限的供体部位的可用性和不完全的功能恢复。因此，迫切需要一种简单有效的治疗方法来促进VML骨骼肌再生。

粉末水凝胶被开发出来，通过吸收界面水来消除组织界面水化层，从而实现湿组织粘附。制备的水凝胶具有较强的组织黏附性，为组织再生提供稳定、贴身的支持。粉末水凝胶为组织再生提供了几个好处，包括快速和大体积去除组织上的水化层，以及适应形状不规则的伤口部位。一些研究已经证明了粉末水凝胶在各种组织再生中的效用。此外，它在动态环境中的稳定性和性能，包括骨骼肌，仍未被探索。因此，开发具有良好生物相容性、生物可降解性、对动态湿组织具有可靠和强粘附性的粉状水凝胶是人们迫切需要的。

大多数研究仅关注其对出血伤口的止血性能，尚未探讨其在组织再生中的适用性。重要的是，由高度改性聚合物组成的粉末可能会引起严重的毒性，副反应以及影响再现性的合成和纯化困难。为了解决这些问题，我们的研究通过结合生物相容性天然聚合物，特别是葡聚糖醛(dex-ald)和明胶，开发了一种湿组织粘合剂聚合物粉末水凝胶，旨在VML后骨骼肌再生。通过简单的改性工艺合成Dex-ald，并与明胶配制，最终得到Dex-ald/明胶粉末。dex-ald/明胶粉末吸收界面组织液，并通过组织上dex-ald和明胶之间的希夫碱反应自发形成原位水凝胶。此外，这种粉末水凝胶主要通过在水凝胶和组织之间形成共价席夫碱而粘附在组织上。我们系统地研究了粉末成分和处理程序对材料性能的影响，如机械、流变学和附着力。此外，我们还利用各种器官对粉末水凝胶的体内性能进行了评估，特别是考察了其黏附强度和止血能力，并与其他湿性水凝胶和纤维蛋白胶进行了比较。最后，通过动物VML模型验证了粉末水凝胶用于骨骼肌再生的可行性。

1 结果与讨论

1.1.dex-ald/明胶粉末水凝胶的制备

将冻干的Dex-ald和明胶混合匀浆，制备Dex-ald/明胶粉末(图2A)。均质后，用300μm筛进行筛分。Dex-ald粉末具有短而破碎的纤维形状，明胶粉末显示出球形形态。粉末的小粒径被期望具有大的表面积以进行快速流体吸附，从而导致快速水化和凝胶化(图2B)。由于界面水大部分被粉末除去，因此在组织/水凝胶界面上没有水化层，这使得粉末的粘附官能团(如醛、羧基、胺和羟基)能够有效地反应并与组织结合。由于这些特性，dex-ald/明胶粉末水凝胶可以很强地粘附在湿组织上。用FT-IR光谱检测PBS处理后形成的粉末水凝胶(图2C)。Dex-ald和明胶在1735cm−1和1633cm−1处表现出典型的醛键峰和酰胺键峰。(图2c)。在dex-ald/明胶水凝胶光谱中，在1056cm−1处出现了席夫碱对应的新峰，而在1735cm−1处的醛峰减弱，表明水凝胶中席夫碱形成成功。进一步孵育后，水凝胶呈现相对均匀的孔隙，表明最终发生交联反应，内部结构均匀。

1.2.dex-ald/明胶粉末水凝胶的力学特性

通过改变dex-ald与明胶的比例(1:2、1:4、1:8和1:16)，配制出各种dex-ald/明胶粉末，分别称为粉末(1:2)、粉末(1:4)、粉末(1:8)和粉末(1:16)，并对其流变特性进行了表征(图3)。首先，在时间扫描模式下监测了PBS处理后粉末水凝胶的流变行为(图3A和B)。加入PBS后，观察到两种不同的模量趋势-(i)初始模量下降和(ii)模量逐渐增加。对于这一观察，我们推测粉末可能经历的两个事件:(i)初始粉末水化与降低模量和(ii)最终交联(凝胶)与增加模量。在水化和凝胶化过程中，弹性模量(G′)均高于粘性模量(G″)，表明粉末水凝胶主要表现为凝胶样行为。由于粉末能迅速吸收溶液，肿胀的粉末即使在早期水化阶段也可能表现出凝胶状的机械行为。颗粒状水凝胶(由水合微凝胶组成)即使没有很强的颗粒间相互作用，其G′也比G′高。在我们的研究中，含有更高比例明胶的粉末表现出更快的水化和更短的凝胶时间(图3C)。粉末(1:2)需要很长时间(约490秒)才能凝胶化，这对于体内应用来说太慢了。此外，明胶比例较高的粉末水凝胶具有更高的模量(图3D)。我们通过在PBS中孵育制备的粉末水凝胶进一步检查凝胶稳定性。醛基密集地位于dex-ald链上(每葡萄糖单位0.58个醛基)，由于空间位阻，它们与明胶中的胺基反应无效。因此，形成稳定的交联水凝胶需要醛的含量高于胺的含量。粉末(1:4)中胺基比醛基多3.3倍(图3E)。基于凝胶时间、模量和稳定性，确定了1:4的粉状水凝胶最适合作为原位成型粉状水凝胶。

1.3.dex-ald/明胶粉末水凝胶的组织粘附性

采用猪皮肤组织进行搭接剪切试验，评估不同比例(1:2、1:4、1:8和1:16)的粉末水凝胶的组织粘附性(图4A)。与商业纤维蛋白胶(2.8kPa)相比，粉末水凝胶具有更高的粘附强度(7.5-15.2kPa)(图4B)。粉末水凝胶的强组织粘附性可归因于组织/水凝胶界面上的共价键和非共价键。dex-ald中的醛基可以与组织中的胺基形成共价席夫碱，这主要有助于组织的粘附。高明胶比(≥1:4)的粉状水凝胶的粘接强度显著高于粉状(1:2)水凝胶(7.5kPa)。

粉末(1:4)水凝胶在模拟体内骨骼肌运动的各种变形条件下(弯曲和扭转)表现出稳定的组织粘附性(图4C)。此外，粉末(1:4)水凝胶即使在水中变形和水冲洗后仍保持稳定，表明在潮湿环境中具有良好的附着力和稳定性。因此，粉状(1:4)水凝胶具有较强且稳定的组织粘附性，适合于VML骨骼肌再生。

1.4.dex-ald/明胶粉末水凝胶的细胞相容性

通过直接和间接接触培养方式培养小鼠C2C12成肌细胞来评估粉末水凝胶的细胞相容性(图5)。在这两种培养方式下，用水凝胶培养的细胞在第1、2和3天的存活率都很高(>97%)，与在组织培养板(TCP)上培养的细胞没有显著差异(图5A和B)。用WST-1法测定代谢活性3天，以研究粉末水凝胶对细胞增殖的影响(图5C)。与对照组(TCP)相似，用粉末水凝胶培养的C2C12细胞在间接接触和直接接触两种方式下均具有良好的增殖能力，且在培养过程中，粉末水凝胶组和TCP组的代谢活性无显著差异。这些结果表明，我们的粉末水凝胶不会损害细胞活力或代谢活性。粉末水凝胶优异的细胞相容性可能与粉末水凝胶成分(明胶和葡聚糖)固有的生物相容性有关。

1.5.dex-ald/明胶粉末水凝胶的体内粘附性、止血性和可降解性

我们通过检查dex-ald/明胶粉末水凝胶的组织粘连性、止血能力和可降解性来检验其作为组织粘连性水凝胶在体内应用的可行性。水凝胶的适当组织粘附对于提供受动态运动的组织(如骨骼肌)之间的可靠连接以及稳定地支持组织再生非常重要。我们研究了粉末(1:4)水凝胶和各种对照(预成型水凝胶、原位成型水凝胶和商业纤维蛋白胶)的体内组织粘附性，并比较了它们的特性(图6)。注意，预成型和原位成型水凝胶与粉末水凝胶的组成相同。我们使用各种器官评估水凝胶样品，包括出血器官(例如，VML损伤的出血性小鼠TA肌和出血性大鼠心脏)和非出血器官(大鼠肝脏、胃和肠)。每个水凝胶都受到水溅在器官上，以评估其附着力和稳定性。在VML损伤的出血性TA肌中，粉末水凝胶和纤维蛋白胶保持稳定，与损伤部位粘附良好(图6B和C)。相比之下，在相同条件下，预形成和原位形成的水凝胶很容易脱落。特别是，预先形成的水凝胶不粘附在任何器官上。原位形成的水凝胶仅粘附在非出血器官上(图6C)。结果表明，这些类型的水凝胶(预成型水凝胶和原位成型水凝胶)不适合治疗无敷料或缝合的伤口。纤维蛋白胶稳定粘附在出血器官上;然而，它与肝脏的粘附不稳定，可能是因为它的表面光滑。相反，粉末水凝胶粘附在所有器官上，包括出血的VML和心脏。我们的粉末水凝胶具有优异的组织黏附性，这是因为干燥的dexald/明胶粉末可以吸收伤口的界面生物液体或血液，并有效地与组织相互作用。

止血对骨骼肌再生很重要。止血材料可以促进骨骼肌的再生，这种止血材料可以快速吸收血液，富集凝血因子，增强组织粘连，并对受伤肌肉进行物理保护。在我们的研究中，使用小鼠出血性肝模型评估了纤维蛋白胶、预成型水凝胶、原位成型水凝胶和dex-ald/明胶粉(1:4)的体内止血能力(图6D和E)。未经任何治疗(对照组)，大量失血量(220±35mg)。同样，预先形成的水凝胶治疗也没有减少失血量(157±20mg)。纤维蛋白胶组(65±8mg)和原位形成的水凝胶组(80±21mg)的失血量显著减少。重要的是，粉末水凝胶组的失血量最低(14±4mg)，证实了dex-ald/明胶粉末具有良好的止血能力，有利于伤口愈合。

1.6.利用dex-ald/明胶粉末水凝胶进行体内骨骼肌再生

通过VML和水凝胶处理后1周和3周的TA肌肉组织学分析，检测dex-ald/明胶粉(1:4)水凝胶对VML损伤后骨骼肌再生的功效(图7A)。我们包括未治疗组和纤维蛋白胶治疗组作为对照。粉末凝胶组在1周和3周时发现明显的再生组织覆盖缺损，比未处理组和纤维蛋白胶组大(图7B)。VML后TA肌中的中心核肌纤维主要作为肌肉再生的指标进行分析。1周和3周时，粉末水凝胶组再生肌纤维面积明显高于纤维蛋白胶组和未处理组(图7C)。例如，1周时，未处理组、纤维蛋白胶组和粉末水凝胶组损伤区域内再生肌纤维的平均面积分别为209±23、237±14和304±39μm2;3周时，未处理组、纤维蛋白胶组和粉末水凝胶组的再生肌纤维面积分别为438±80、468±58和703±127μm2。第1周和第3周再生肌纤维区域的分布表明，粉末水凝胶组的大纤维数量多于未处理组和纤维蛋白胶组(图7D)。这些结果表明，粉末水凝胶对VML损伤后肌肉再生有显著促进作用。通过分析马松三色染色图像中的胶原沉积来评估瘢痕组织的形成(图7E)。与其他组相比，粉末凝胶组TA肌力的恢复最大，而纤维蛋白胶处理也比未处理的对照组促进了肌力的恢复。例如，未治疗组、纤维蛋白胶组和粉末胶组的肌力恢复率分别为38.2±5.5%、53.6±11.0%和89.0±5.5%。这种功能性肌肉力量恢复的改善与组织学评估中观察到的趋势(例如，有核肌纤维区域)密切相关。

肌肉再生不足或不适当通常伴随着病理性组织重塑和纤维化。VML损伤治疗1周后，粉末水凝胶组的纤维化面积较未治疗组明显缩小(图7F)。3周后，各组纤维化面积均减小，且纤维化面积均小于对照组。如未治疗组、纤维蛋白胶组、粉末水凝胶组3周纤维化面积分别为26.3±3.5%、24.5±2.9%、18.9±2.4%。上述结果表明，粉末水凝胶处理具有较强的组织粘连性和机械支持作用，可显著促进VML损伤后骨骼肌再生，瘢痕组织减少。

除了提供充足的氧气和营养物质外，血管化还可以激活常驻卫星细胞，促进肌肉祖细胞向损伤部位迁移以进行肌肉再生。因此，在样本处理的肌肉组织血管化分析，以评估骨骼肌再生。治疗1周后，与未治疗组相比，粉末水凝胶组损伤组织中新血管形成增加(图8A)。3周后，各组血管形成进一步增强，粉状水凝胶组血管形成高于未处理组和纤维蛋白胶组。此外，由于巨噬细胞在炎症中起关键作用，我们通过组织巨噬细胞的免疫染色检查了损伤部位的炎症组织反应。巨噬细胞可以诱导或消除炎症，这取决于它们的微环境。巨噬细胞分化为炎症型(M1)或抗炎型(M2)。过多的炎性巨噬细胞会放大炎症并诱导瘢痕组织形成。在我们的研究中，表型VML损伤部位的巨噬细胞通过F4/80(一种泛巨噬细胞标记物)和CD206(一种抗原)双重染色进行评估抗炎巨噬细胞标记)(图8B)。治疗1周后，粉水凝胶组F4/80(+)/CD206(+)细胞出现频率明显高于其他组。抗炎(M2)巨噬细胞可促进成肌细胞生长和分化，促进骨骼肌再生。总之，粉末水凝胶治疗促进了血管生成和抗炎组织反应，从而改善了骨骼肌再生，减少了疤痕组织。

2.结论

我们成功地开发了湿粘粉，它可以吸收伤口界面的水，并形成具有强组织粘附力的水凝胶，使用生物相容性和可生物降解的凝胶和明胶。由1:4(dex-ald:明胶)比例组成的dex-ald/明胶粉末显示出有利于骨骼肌再生的特性，例如即使在潮湿环境中也能与伤口部位强粘附，具有机械支撑、止血和可降解性。粉末水凝胶显著改善骨骼肌再生，减少瘢痕组织形成。免疫组织学分析显示，粉末水凝胶可诱导VML损伤骨骼肌血管生成和抗炎巨噬细胞极化。总的来说，我们的dex-ald/明胶粉末水凝胶在促进VML损伤骨骼肌再生方面表现出显著的功效，将为开发基于生物材料的各种组织再生策略提供一个有前景的平台。

本研究由韩国科学、信息通信技术和未来规划部资助的韩国国家研究基金会(NRF)资助。

The title of the article is “Wet tissue adhesive polymeric powder hydrogels for skeletal muscle regeneration”,

DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.06.017

翻译：黄林薇，温州医科大学

校稿：沈建良，温州医科大学