近期，复旦大学高分子系俞麟教授在Bioactive Materials上发表研究文章：长效释放一氧化氮的热致水凝胶介导细胞自噬的抑制来放大温和磁热疗的抗肿瘤效果。该研究制备了一种可多次磁热疗（MHT）且长效释放一氧化氮（NO）的热致水凝胶制剂，该制剂在实现精确温和MHT的同时，通过充足的NO供应抑制了温和MHT诱导的细胞自噬，从而大幅提升了温和MHT的抗肿瘤效果。
01
由于交变磁场（AMF）的穿透深度不受限制，故MHT对实体肿瘤的治疗潜力日益受到关注。在热应激条件下，细胞自噬这一细胞自我修复途径的激活会造成肿瘤细胞的耐热性，从而会削弱温和MHT的疗效。NO是一种人体内源性的气体分子，研究表明，其可以阻碍自噬体的生成从而抑制细胞自噬。但NO极短的体内半衰期使其到达目标部位之前会很快会被全身循环系统所清除。因此，实现肿瘤部位持续且充足的NO递送仍然是一个挑战性的难题。为了解决上述问题，该文章制备了一种可以长效释放NO的PEG-聚氨基酸共聚物热致水凝胶（NO-Gel）材料，并作为载体负载了Zn0.5Fe2.5O4磁性纳米粒子（MNPs），从而得到了可注射的MNPs@NO-Gel水凝胶体系。由于MNPs在水凝胶中的均匀分散以及水凝胶对MNPs的牢固固定，仅一次注射后，MNPs@NO-Gel就可实施多次温和MHT。同时，温和MHT可加速NO的释放，而释放的NO既阻碍自噬体的形成，也破坏了溶酶体，从而有效抑制了细胞自噬，使得温和MHT的抗肿瘤效果得到了显著提升。可注射的MNPs@NO-Gel体系提升温和MHT抗肿瘤效果的机理如下面的示意图所示。
示意图. MNPs@NO-Gel体系的构建及其提升温和MHT抗肿瘤效果的机理图
一.
研究团队通过多步反应合成了侧基修饰有大量NO供体的PEG-聚氨基酸嵌段共聚物（NO-polymer），同时通过高温裂解法制备了具有立方体形貌且基于磁滞损耗机制产热的Zn0.5Fe2.5O4 MNPs。
图1. NO-polymer和MNPs的合成与表征
二.
两亲性的NO-polymer具有温敏特性。在微观层面，NO-polymer在水溶液中能够自组装形成核壳结构的胶束（NO-micelles），并且NO-micelles随着温度的升高会自发发生聚集。当聚合物浓度达到临界凝胶化浓度（8 wt%）或以上时，NO-polymer的水体系在低温下是自由流动的溶胶（sol），而随着升温能够呈现sol-gel相转变，转变成为半固体的物理水凝胶（NO-Gel）。同时，MNPs的引入并没有显著影响NO-Gel的热致凝胶化的性能。
图2. NO-polymer的微观自组装行为以及宏观热致成胶的性质
三.
相较于水，NO-Gel更有利于MNPs的均匀分散并能够防止其由于聚集而发生沉淀，因此，MNPs在NO-Gel中的磁热转化效率相较于其在水中提升了近5.5倍，其比损耗功率（SLP）和本征损耗功率（ILP）分别达到了1878 W/g和2.88 nH m2/kg。在对人体安全的磁场条件下（17.6 kA/m, 282 kHz），MNPs@NO-Gel体系仍然具有良好的磁热性能。同时，体外实验证实，MNPs@NO-Gel能够持续释放MNPs和NO超过三周，并且温和MHT过程还可以加速NO-Gel释放NO。
图3. MNPs的磁热转化效率以及MNPs@NO-Gel的体外释放行为
四.
细胞实验显示，NO-micelles易于被CT-26结肠癌细胞摄取并在胞内释放出NO，同时温和热疗（42 °C）可以加速NO的释放。CCK-8实验证实，细胞内释放的NO提升了温和热疗对CT-26结肠癌细胞的杀伤效果，并通过加入自噬促进剂雷帕霉素（Rapa）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）确认了NO对温和热疗抗肿瘤效果的提升与细胞自噬的抑制相关。
图4. 细胞内NO检测及NO对温和热疗抗肿瘤效果的影响
五.
研究团队通过Western blot实验发现，温和热疗使LC3B-II蛋白的表达上调而使p62蛋白的表达下调，表明温和热疗确实诱导了细胞自噬的激活。而细胞内大量释放的NO则能够使LCB-II蛋白的表达下调而p62蛋白的表达上调，表明NO有效抑制了温和热疗所激活的细胞自噬。进一步的细胞器染色实验证实，在NO-micelles的参与下，细胞内的自噬体和自噬溶酶体的表达水平显著下降，揭示NO通过抑制自噬体的生成并
同步破坏溶酶体来共同抑制细胞自噬，从而提高了温和热疗的抗肿瘤效果。
图5. NO抑制细胞自噬的机理研究
六.
研究团队通过小鼠皮下降解实验证实，注射后的MNPs@NO-Gel体系在体内可维持超过一个月，MNPs在体内的释放受NO-Gel的降解速率控制，并且释放出来的MNPs主要通过脾脏进行代谢。
图6.MNPs@NO-Gel的体内降解以及MNPs的体内释放和代谢
七.
图7. 在小鼠荷瘤区域注射MNPs@NO-Gel体系后，3次MHT过程中的温度示踪
图8. 体内抗肿瘤的效果
综上，该研究团队针对肿瘤的MHT以及NO应用所遇到的问题，开发了可长效释放NO并具有高效磁热转化效率的复合水凝胶体系，通过抑制细胞自噬显著提升了温和MHT的抗肿瘤效果。该工作为提升包括温和MHT在内的温和热疗的疗效提供了有益的借鉴，同时有助于人们加深对NO介导的细胞自噬抑制机理的理解。
02
王耀本（第一作者）：复旦大学高分子科学系博士研究生，主要从事可注射热致水凝胶及其医学应用的研究。
俞麟（通讯作者）：复旦大学高分子科学系暨聚合物分子工程国家重点实验室教授、博士生导师。主要从事可降解医用高分子材料的研究。主持国家自然科学基金面上项目、国家重点研发计划课题以其省部级项目多项。在Chem. Soc. Rev.、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Funct. Mater.、Biomaterials、Bioactive Materials、Macromolecules、J. Chem. Edu. 等学术刊物上发表论文一百余篇。目前担任中国生物材料学会会刊Regenerative Biomaterials的编委，上海生物医学工程学会生物材料专业委员会秘书长、中国生物医学工程学会组织工程与再生医学分会常务委员、中国生物材料学会血液净化材料分会委员、上海市生物医学工程学会医疗器械标准化技术委员会委员等。
03
该研究获国家自然科学基金（21975045）和上海自然科学基金（23ZR1406800）的支持。
04
Yaoben Wang, Xiaobin Chen, Zhiyong Chen, Xin Wang, Hancheng Wang, Huajuan Zhai,
Jiandong Ding, Lin Yu*. Autophagy inhibition mediated via an injectable and NO-releasing hydrogel for amplifying the antitumor efficacy of mild magnetic hyperthermia. Bioactive Materials, 39 (2024) 336-353. DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.05.032
