贻贝启发的硫酸透明质酸低温凝胶贴片具有抗氧化，抗炎，和药物负载特性的多功能伤口粘合剂

本文提出了一种专注于利用硫酸透明质酸(sHA)，通过将儿茶酚基团偶联到sHA上的方法，具有以下优势 1)通过与儿茶酚修饰的高分子量透明质酸交联制备贴片2)粘附性使其稳定定位3)自由基清除可以与sHA的免疫调节协同作用。sHA-CA贴片在糖尿病伤口、肝出血和术后粘连的小鼠伤口模型中显示出治疗效果，强调了sHA-CA贴片作为下一代伤口敷料的潜力。

引言 

“伤口”被定义为破坏活组织内解剖和生理完整性的损伤或破裂。然而，在糖尿病患者中，炎症和代谢失调加剧了伤口的严重程度，导致全世界每年有910—2610万例糖尿病溃疡。另一方面，不受控制的伤口愈合过程可以诱发另一种病理问题。许多伤口敷料专门为每个伤口的情况下，已开发治疗伤口。如修复皮肤创面的创面敷料，止血纱布，防止术后粘连的抗粘连屏障。此外，高性能创面贴片也得到了积极研究。然而，很少有人尝试开发一种可以治疗多种适应症的功能性伤口敷料。如果有一种多功能伤口敷料来处理这些不同类型的伤口，将增加便利性，降低成本，并扩大其有效性，以覆盖复杂症状的伤口。

组织黏附透明质酸(HA)水凝胶被认为是一种有效的伤口敷料治疗选择。儿茶酚偶联透明质酸(HA-ca)水凝胶可以在氧化条件下通过儿茶酚基团之间的交联制备。这种水凝胶很容易粘附在潮湿的器官表面，并且稳定地定位在目标上。然而，Ha基生物材料表现出一定的局限性。与肝素等其他阴离子糖胺聚糖(GAGs)不同，它们的弱负电荷可能不足以通过静电相互作用装载阳离子药物。此外，还有发炎的风险。降解过程中会产生低分子量的HA及其衍生物，可引起植入部位的炎症。克服羟基磷灰石局限性的一种策略是通过羟基磺化将其修饰成硫酸羟基磷灰石(sHA)。与HA相比，sHA有一些优点。首先，由于硫酸基团阻碍透明质酸酶的反应，在体内抵抗降解，因此sHA的稳定性优于HA。其次，由于sHA的阴离子电位增强，阳离子药物可以有效结合并持续释放。其三，sHA通过抑制NF‑κB核易位调节M1(促炎)‑M2(抗炎)复极化，其抗炎特性可促进伤口愈合。因此，sHA的上述多功能特性使其适合用作伤口敷料。

在本研究中，我们合成了sHA‑CA，并通过将sHA‑CA与HA (HMW)‑CA交联制备了多功能干胶低温凝胶贴片。为了使sHA‑CA与HA(HMW)‑CA交联，在碱性条件下采用冻融法制备了贴片。碱性条件下，儿茶酚被氧化为邻醌，参与与其他邻醌的交联反应。冷冻通过诱导冰晶和冰晶间聚合物的定位加速氧化儿茶酚之间的交联。干燥贴片可使其黏附性最大化，使其能够吸收目标表面的液体。与商用氰基丙烯酸酯胶相比，该干胶低温凝胶贴片对湿组织具有优异的粘附性。此外，sHA‑CA克服了透明质酸的快速降解，这一直是透明质酸在生物材料应用中的代表性限制。sHA的阴离子电荷可以装载阳离子生物活性蛋白，增强了sHA对各种疾病的效用。此外，由于其固有的抗炎机制，该贴片具有免疫调节和减轻炎症的功能。

为了证明sHA‑CA贴片作为多功能伤口敷料的治疗潜力，我们使用三种不同的口模型进行了疗效测试。1)糖尿病创面模型:sHA‑ca贴片通过儿茶酚清除自由基和巨噬细胞M2极化，建立抗炎环境，支持糖尿病创面愈合。2)肝出血模型:透明质酸具有吸收和保留大量水分的能力。利用这两个方面，干sHA‑CA贴片通过吸收肝出血中的血液表现出止血作用。此外，在贴片中加入凝血酶后，其吸血能力与凝血酶活性协同作用，具有极快的止血功能。3)术后粘连模型:当将sHA‑CA贴片应用于盲肠磨损模型时，贴片迅速去除表面水分并牢固粘附在目标区域。这种物理屏障的形成以其固有的抗炎特性有效地防止了腹膜粘连。这些实验共同说明了sHA‑CA贴片在各种伤口情况下作为多功能伤口敷料的功效。

1. sHA-CA贴片的制备及化学表征

通过儿茶酚氧化，将HA(HMW)‑CA和sHA‑CA的预凝胶混合物交联，形成sHA-CA贴片将其pH值调整为9，促进了儿茶酚氧化为邻醌，其自由基随后反应形成交联。此外，冻融还增强了交联过程。这一步通过形成冰晶来浓缩溶液，有助于形成网络。这种凝胶制造工艺的简单性和温和性潜在地增加了它的生物相容性，使其更适合生物医学应用。儿茶酚基团增强了贴片的组织黏附性，有助于sHA‑CA贴片的定位和稳定作用。此外，通过清除伤口处的活性氧，在应用期间炎症减轻。sHA在sHA‑ca中的主要作用是对巨噬细胞进行免疫调节，促进其向M2表型极化。这种抗炎特性可能与儿茶酚清除活性氧的特性协同作用。并且由于sHA‑ca的负电荷，它可以保留阳离子药物，可以加速治疗效果，具有广泛的应用前景。

2 HA-CA贴片的理化性质

为了优化贴片配方，我们制作了不同sHA‑CA含量的贴片:0%、0.1%和0.2%。(图2)。将HA(HMW)‑CA/sHA‑CA预凝胶溶液的pH值增加到9，诱导自氧化，导致儿茶酚氧化为醌，并导致醌部分之间的交联。这一过程使sHA‑CA斑块的颜色变暗，并导致氧化后的网络结构更致密。氧化在3h的时间内改变了280 nm处的吸光度曲线，并且在紫外-可见光谱研究中显著增加了HA(HMW)‑CA/sHA‑CA的总体吸光度。氧化后280 nm处的吸光度上升，表明存在由交联儿茶酚分子衍生的各种氧化产物。采用x射线光电子能谱(XPS)分析进一步证实儿茶酚氧化导致连续交联，表明sHA‑CA斑块中C‑C键水平升高和HA-CA斑块中儿茶酚的活化。这表明HA(HMW)‑CA中的儿茶酚部分在氧化碱性条件下被激活，形成邻醌基团并随后交联。

3. sHA‑CA补丁的物理化学性质和粘附性

流变学分析显示，在1‑100 rad/s频率范围内的频率扫描测试中，sHA‑CA组在存储(G’)和损耗模量(G”)方面没有显著差异，表明凝胶网络形成稳定。水凝胶的降解特性是表征交联密度的另一个指标。透明质酸酶对透明质酸的快速降解被认为是透明质酸作为生物材料的代表性限制。然而，通过阻碍透明质酸酶的作用，sHA可以比HA保持更长的结构。在降解试验中，sHA‑CA补丁的增强持久性表明了更持久性能的潜力，特别是在关注快速HA‑CA退化的应用程序中。

水凝胶的膨胀比代表了凝胶的交联密度。sHA‑CA贴片肿胀后的体积增加，各组肿胀率差异无统计学意义。由于HA (HMW)‑CA矩阵是sHA‑CA贴片力学性能的主要组成部分，因此各组之间的网络密度相似。为了评估sHA‑CA贴片在湿组织上的粘附强度，我们按照ASTM F2255指南进行了标准的拉剪试验。与氰基丙烯酸酯(一种代表性的商业粘合剂)相比，这些贴片表现出显著的粘合强度曲线。sHA‑CA的粘附强度超过了氰基丙烯酸酯的粘附强度，因为氰基丙烯酸酯无法去除猪皮表面的水分子。考虑到我们体内的器官通常保持湿润状态，sHA‑CA贴片的吸水特性对于生物医学应用作为生物粘合剂是有利的。

4. sHA‑CA贴片的体外生物相容性和免疫调节特性

为了评估sHA‑CA贴片的生物相容性，使用Live&Dead法评估了体外细胞相容性。结果显示对照、sHA‑CA 0%、sHA‑CA 0.1%和sHA‑CA 0.2%补丁各组活细胞百分率均超过95%，符合国际标准70%的要求，证实了sHA‑CA贴片的细胞相容性。

为了研究sHA‑CA对巨噬细胞免疫调节的协同作用，我们通过免疫细胞化学和细胞因子定量分析了sHA‑CA贴片处理后活化的RAW 264.7细胞。我们发现了sHA和儿茶酚之间的免疫调节协同关系。用sHA‑CA贴片处理RAW 264.7细胞后，分析培养上清中促炎细胞因子TNF-α水平和一氧化氮(NO)。所有sHA‑CA贴片，包括sHA‑CA 0%组，都降低了TNF-α的表达。斑块中sHA‑CA含量越高，TNF-α表达越低。来自斑块的儿茶酚部分的自由基清除和sHA的免疫调节特性可能有助于TNF-α表达的衰减。所有sHA‑CA贴片均显著降低NO水平，这可能归因于贴片的自由基清除特性。为了证实sHA‑CA贴片的免疫调节功能，我们进行了额外的流式细胞术分析，量化了RAW 264.7细胞中CD80 (M1)和CD206 (M2)的表达。LPS处理的RAW 264.7细胞CD80表达增加，添加sHA‑CA似乎增加了RAW264.7细胞中CD206的表达，这可能归因于sHA‑CA的抗炎特性。

综上所述，sHA‑CA贴片具有良好的生物相容性，可以调节RAW264.7细胞的M1‑M2状态。

5. sHA-CA贴片的体内生物相容性和体内保留率

在将sHA-CA贴片应用于疾病模型进行治疗之前，确认了sHA‑CA贴片的体内生物相容性。我们使用鲁米诺作为炎症检测试剂，它可以被炎症中中性粒细胞和单核细胞中的髓过氧化物酶激活。与乳胶珠相比，其他组正常皮肤的信号表现出微弱或没有差异。然而，当比较sHA‑CA贴片时，除乳胶珠外，sHA‑CA贴片(sHA‑CA 0%)的发光比正常皮肤高2倍。sHA‑CA贴片(sHA‑CA 0.1%和0.2%)显示基底发光，这意味着它们在体内没有免疫原性。含有药物的贴片也很低。从这些结果来看，很明显sHA‑CA贴片是安全的，可以用作治疗应用的生物材料。

调节生物材料的降解时间对其治疗应用至关重要。创面炎症至少可持续2-6天，术后粘连通常发生在术后3-5天。因此，生物材料至少需要7天的保留时间。为了检验sHA‑CA贴片在体内的滞留时间，我们将直径为8 mm的贴片皮下植入C57BL/6小鼠，并在特定时间点(植入后4天、7天、11天、14天)采集。结果表明sHA‑CA贴片中sHA‑CA浓度越高，速度越慢。

6. sHA‑CA贴片对糖尿病创面愈合的影响

为了加速异常和缓慢的创面愈合过程，我们将贴片局部应用于糖尿病创面。在糖尿病C57BL/6小鼠的伤口愈合中，我们测试了含有或不含有VEGF165的sHA‑CA贴片的效果。结果表明，含有VEGF165的抗炎sHA‑CA贴片加速了糖尿病伤口愈合，在手术后14天内达到接近0%的伤口面积。为了说明sHA‑CA贴片作为糖尿病伤口敷料的有效性，我们分析了用sHA‑CA贴片治疗的伤口组织。创面部位iNOS和Arg1的免疫组化结果显示，对照组中iNOS细胞占主导地位，而sHA‑CA贴片组和sHA‑CA贴片/VEGF组中Arg1细胞更为丰富。根据组织样品中iNOS和Arg1细胞的测量，我们计算了M1/M2比值。结果表明在应用过程中，sHA‑CA贴片对巨噬细胞的M2极化有较强的促进作用。

为了量化炎症水平，我们在手术后4天测量了小鼠血清中的促炎细胞因子。量化创面组织中TNF‑α、IL‑6和IL‑12p70水平。在所有测试的细胞因子中，sHA‑CA贴片组和sHA‑CA贴片/VEGF组的促炎细胞因子水平显著降低。这些结果表明，sHA‑CA的抗炎功能，结合持续的药物释放，加速了糖尿病伤口模型的伤口愈合。

7. sHA‑CA贴片对肝出血模型的止血作用

sHA‑CA贴片可以通过吸收血液和与血浆蛋白相互作用有效止血。此外，其在出血部位的粘附特性有助于止血，防止出血。在将sHA‑CA贴片应用于出血场景之前，我们进行了测试，以评估sHA‑CA是否会对血细胞产生任何血液毒性作用。血液相容性通过使用sHA‑CA贴片进行溶血试验来评估，与Triton X‑100(阳性对照)相比，凝血酶和sHA‑CA贴片，无论是否含有凝血酶，都表现出血液相容性，溶血率低于1%。数据符合国际标准ISO 10993‑5的5%，证实了sHA‑CA贴片具有良好的血液相容性。

为了比较两种材料的止血能力，我们进行了体外凝血试验。在所有组中，观察到血小板活化的显著趋势。血小板聚集并呈现泡状形态。凝血酶与血液接触后，立即形成稳定的凝块。sHA‑CA贴片的快速吸血特性，结合贴片内载凝血酶的作用，可以为sHA‑CA贴片作为止血剂提供协同作用。

为了评估装载凝血酶的sHA‑CA贴片的止血性能，我们建立了肝出血模型。出血前后分别称重滤纸和sHA‑CA贴片，定量测定出血量。sHA‑CA贴片组与凝血酶组失血量差异无统计学意义。sHA‑CA贴片的吸血能力及其稳定的贴片样结构允许立即止血，并且通过将凝血酶加载到贴片中进一步加速凝血过程。

8. sHA-CA贴片对术后粘连的粘附屏障功能

与商业产品sepilfilm^®相比，sHA-CA贴片被证明是一种优越的粘附屏障。这表明，仅仅在受伤组织之间提供物理屏障不足以防止粘连。为了更深入地了解促进sHA‑CA贴片作为粘附屏障性能改善的因素，我们分析了术后7 d收集的组织样本中的炎症水平。综上所述，sHA‑CA贴片影响了M1‑M2巨噬细胞的极化，增加了盲肠和腹壁损伤部位M2巨噬细胞的存在。这支持腹膜伤口愈合，这些特点有助于有效预防术后粘连。

此外，sHA‑CA贴片显著降低盲肠磨损模型中的促炎细胞因子水平。术后4 d取大鼠颈静脉采血，分离血清进行细胞因子分析。由于术后细胞因子快速清除的潜在风险，腹膜灌洗液被排除在细胞因子分析之外。促炎因子IL‑1β、IL‑6和TNF‑α在sHA‑CA贴片组显著降低。与对照组相比，IL‑1β和TNF‑α表达相似，IL‑6表达升高。因此，sHA‑CA贴片通过诱导损伤部位的M2极化和减弱促炎细胞因子，有效地预防了腹膜粘连。

9. 结论

综上所述，我们已经成功地开发了适合三种不同类型伤口的多功能干贴。通过将pH值调整为9并利用冻融技术，我们能够通过儿茶酚交联制造贴片。sHA‑CA贴片表现出改善的机械性能，包括增强的保持性和粘附性。此外，sHA‑CA中的硫酸盐基团能够促进阳离子药物的缓释。此外，我们的研究表明，sHA‑ca贴片具有协同抗炎潜力，其儿茶酚部分具有清除自由基的能力，并能够通过sHA下调促炎细胞因子的表达。这种抗炎功能在体内通过sHA‑CA贴片植入后的炎症水平成像和细胞因子水平的量化进一步证实。最终，具有生物相容性和抗炎性的sHA‑CA贴片在治疗糖尿病伤口、肝出血和术后伤口方面表现出显著改善的治疗效果。这些发现支持了sHA‑CA贴片可以为广泛的体内应用提供一种新颖而有前途的治疗策略的观点。

韩国科学和信息通信技术部；韩国政府资助的韩国再生医学基金

The title of the article is “Mussel-inspired sulfated hyaluronan cryogel patch with antioxidant, anti-inflammatory, and drug-loading properties for multifunctional wound adhesives

DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.08.001

翻译：葛鑫鑫，温州医科大学

校稿：沈建良，温州医科大学