STING激活型树突状细胞靶向纳米疫苗唤起强效用于癌症免疫治疗的抗原交叉呈递

近年来，基于纳米疫苗的免疫疗法因其调控免疫反应和产生长期保护性免疫的潜力备受关注。1型常规树突状细胞(cDC1)在将外源抗原交叉呈递给CD8+T细胞中起关键作用。DC衍生的Si9GM纳米疫苗通过靶向cDC1实现STING介导的抗原交叉呈递，激活I型干扰素，同时上调细胞毒性T细胞，减少肿瘤Tregs，促进M1/M2极化，并与αPD-1阻断协同作用，展现了其在临床免疫治疗中的潜力。

引言

免疫监视是通过免疫系统识别并消除危险信号的监控过程。当癌细胞逃逸时，免疫系统失去了消除肿瘤和修复功能的能力。因此，近年来嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法、癌症疫苗接种以及免疫检查点抑制(ICB)等癌症免疫疗法成为癌症治疗的基石。与细胞膜包裹的纳米颗粒相关的纳米技术有望在抗癌治疗中取得重大突破，这种技术利用表达免疫细胞源蛋白质的仿生细胞膜，延长纳米颗粒的血液循环时间，从而具备抗原选择性靶向、逐步释放货物以及增强体内生物相容性的潜力。树突状细胞(DCs)在抗原呈递中至关重要。DC膜主要表达主要组织相容性复合体(MHCs)，这些是DC与T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和B细胞等其他免疫细胞之间沟通的关键膜蛋白。DC膜包裹的纳米颗粒在肿瘤抗原的存在下作为人工抗原呈递细胞(APCs)，迁移至淋巴结与T细胞相互作用，促进强大的抗癌免疫反应。

最近，干扰素基因刺激因子(STING)被应用于抗癌治疗，作为一种危险感应器，能够有效检测病原体。然而，由于STING激动剂清除迅速、膜渗透性差、亲水性强以及小分子特性，临床数据表明其在患者中的疗效有限。纳米疫苗作为一种有前景的策略，通过共递送抗原和佐剂，解决了这些挑战。通过激活STING途径，I型干扰素的产生驱动多方面的免疫功能，促进树突状细胞的成熟和肿瘤抗原的交叉呈递，增强T细胞介导的免疫反应。尽管STING蛋白在DC中大量表达，选择性激活DC的研究有限。因此，针对特定免疫细胞如DC的STING激动剂选择性刺激非常关键。1型常规树突状细胞(cDC1)已被发现能够促进先天和适应性免疫反应，特别是在纳米疫苗治疗中，cDC1能够摄取纳米疫苗来源的抗原，并在迁移至肿瘤引流淋巴结或肿瘤微环境后将抗原呈递给CD8+T细胞。因此，在cDC1中选择性地进行抗原交叉呈递在癌症免疫疗法中引起了广泛关注。

CLEC9A是cDC1细胞上表达的一种C型凝集素内吞受体，负责抗原的内吞摄取并启动随后对CD8+T细胞的抗原交叉呈递。内吞的抗原-CLEC9A复合物与溶酶体隔离，促进抗原的有效回收以进行交叉呈递，从而提高癌症免疫疗法的有效性。此外，研究表明，与靶向cDC1上另一个受体DEC205的抗原相比，CLEC9A靶向抗原能够引发更强的免疫反应。因此，利用CLEC9A靶向的纳米疫苗选择性激活cDC1中的STING通路，具有推动癌症免疫疗法研究的巨大潜力。

本研究开发了一种基于骨髓DC的纳米疫苗(命名为Si9GM)，由表达抗原肽的骨髓来源树突状细胞(BMDC)膜包裹具有中心径向大孔的二氧化硅纳米颗粒组成，用于有效递送αCLEC9A-抗原偶联物和STING激动剂(2′3′-cGAMP)。我们在体外分离并刺激BMDC，随后通过包裹CD8+T细胞特异性抗原片段(OVA257-264)获得抗原肽呈递的决定簇(命名为M)。CLEC9A抗体偶联的OVA257-264片段和2′3′-cGAMP被装载在二氧化硅纳米颗粒的大孔中，以便共同递送并防止酶降解。该纳米疫苗在T细胞激活和DC成熟，尤其是在不可或缺的cDC1亚群中，起到了双重作用。值得注意的是，释放的抗原-CLEC9A偶联物和2′3′-cGAMP在cDC1中分别通过交叉抗原呈递和I型干扰素产生发挥了关键作用。纳米疫苗在淋巴结中的归巢能力通过纳米疫苗的广泛积累(与单独注射STING激动剂相比)得到了验证，我们研究了其在产生抗肿瘤效果方面的能力。我们还证明，与αPD-1阻断剂联合使用可以显著抑制肿瘤生长并防止转移。这种有前途的治疗效果表明，基于DC的纳米疫苗在个性化癌症免疫疗法和精准医学中的多方面功能。

1. BMDC纳米疫苗Si9GM的制备

这项研究开发了一种新型的树枝状硅纳米颗粒(DHPSiNPs)，用于递送大分子药物，如2′3′-cGAMP。DHPSiNPs具有中心辐射大孔结构，能够有效加载并释放大分子药物。通过改性胺基为羧基并引入低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)，提高了对2′3′-cGAMP的包封效率至53%，相比原始的DHPSi-NH2颗粒(9%)大幅提升。功能化表面通过Zeta电位和FTIR确认了成功的化学改性。

研究还从小鼠骨髓中提取并刺激了树突状细胞(BMDCs)，获得了纯度超过84%的成熟BMDCs。通过提取和存储过程，验证了BMDC膜(BMDCm)的完整性和免疫标志物保留。进一步的SDS-PAGE和Westernblot分析确认了膜蛋白的稳定性和分离效果。

将OVA257-264抗原片段加载到BMDCm的MHCI分子上，并与αCLEC9A偶联生成DC-OVA257-264纳米疫苗。流式细胞术和WesternBlot确认了抗原片段的成功加载。纳米颗粒的表面涂层和胶体稳定性通过TEM和SEM验证。电镜图像显示了BMDC膜的有效包覆，确保了膜表面免疫标志物的保存。

2. Si9GM纳米颗粒增强了2′3′-cGAMP在树突状细胞中的摄取

为了验证BMDC衍生纳米疫苗在DCs中的细胞摄取，我们使用生物透射电子显微镜(bio-TEM)和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)。结果显示，Si9GM（黄色箭头）在8小时内被BMDCs内部化(图2A)。CLSM显示BMDCs和Si9GM分别被绿色和红色荧光染色，合并图像中黄色区域表明纳米疫苗的成功内部化(图2B)。在DC2.4细胞系中也得到了类似结果(图S10)。通过CLEC9A受体阻断实验，我们发现Si9GM在cDC1细胞中的摄取(54.5±2.15%)明显高于CLEC9A阻断的cDC1(44.1±0.36%)，而SiGM纳米疫苗在不同条件下的摄取相似(图S11B)。

进一步通过CLSM研究了DHPSi-PEINPs对αCLEC9A-OVA257-264和2′3′-cGAMP的递送(图2C和图S12、S13)。结果显示，红色荧光和绿色荧光分别代表αCLEC9A-OVA257-264结合物和cFAET标记的2′3′-cGAMP，验证了其共同装载。Si9GMNPs在内体/溶酶体中逃逸的有效性通过荧光重叠的微不足道存在(黄色区域)得到评估，支持了抗原肽在MHCI分子上的呈递和STING途径的激活(图2D)。相比之下，自由的2′3′-cGAMP逃逸溶酮体的能力较低(图S16)。

流式细胞术分析显示，Si9GMNPs对2′3′-cGAMP的递送更为有效，cDC1细胞中65.8±5.27%为cFAET-2′3′-cGAMP阳性，而自由STING激动剂的摄取最大值为16.8±1.12%(图2E和F)。此外，Si9GM对αCLEC9A-OVA257-264结合物的递送也优于自由结合物，中心-径向大孔结构显著提高了高分子量结合物的摄取(65.1±2.42%vs.40.3±3.42%)(图2G。

3. Si9GM纳米粒子作为人工抗原呈递细胞在直接激活CD8T细胞中发挥关键作用

为验证Si9GM纳米疫苗作为人工抗原呈递细胞(APC)的作用，我们将Si9GM纳米疫苗与从小鼠脾脏分离的CD8+T细胞孵育。观察到Si9GM纳米粒子(红色荧光)与T细胞表面(绿色荧光)发生相互作用，表明OVA257-264-MHCI复合物能够促进CD8+T细胞的结合，证明Si9GM纳米粒子具备人工APC的功能(图3A)。在没有加载OVA257-264片段的Si9GM处理下，T细胞和纳米粒子间的相互作用较少，大多数Si9GM粒子集中在细胞质中(图S18)。STING激动剂特异性地诱导T细胞凋亡，不影响BMDCs或BMDMs。因此，加载OVA257-264抗原片段到成熟BMDC膜上不仅激活T细胞，还防止了因细胞摄取导致的T细胞凋亡。与OVA257-264加载的成熟BMDC膜(DC-OVA，38.3%)和未成熟BMDC来源的Si9GM(Si9GimM，25.9%)相比，Si9GM处理的CD8+T细胞激活率达到49.9%(图3B和C)。Si9GM纳米疫苗显示了最强的T细胞增殖(图3D和E)和对B16-OVA癌细胞的杀伤效能(图3F和G)。与Dynabeads小鼠T激活剂CD3/CD28比较，Si9GM表现出优越的T细胞激活性能，为癌症免疫治疗提供了潜力。

4. Si9GMs促进STING通路激活并增强树突状细胞成熟

许多研究表明，2′3′-cGAMP与内质网膜上的STING二聚体结合，促进STING从内质网向高尔基体的转位，从而触发STING的寡聚化，并激活下游信号通路。图4A显示，STING促进TANK结合激酶1(TBK1)的招募，提高其自磷酸化(p-TBK1)、STING和干扰素调节因子3(IRF3)的磷酸化。p-TBK1促进IRF3二聚体化，这些二聚体转移至细胞核，诱导I型干扰素(IFN)和其他炎症基因的表达。同时，STING激活还导致核因子κB(NK-κB)的磷酸化，促进一系列促炎细胞因子的转录。西方印迹分析显示，与自由2′3′-cGAMP相比，Si9GM处理的BMDCs中TBK1、STING、IRF3和NK-κB的磷酸化水平均有所提高(图4B)。此外，Si9GM处理的BMDCs中IFN-β生产量也高于2′3′-cGAMP处理组(图4C)，表明Si9GM能显著增强STING信号通路和I型IFN产生，促进DC激活和免疫反应。

在体外研究中，Si9GM显著促进了BMDC的成熟，表现为CD40、CD80、CD86和MHCII的上调(图4D)。Si9GM处理的BMDCs中SIINFEKL+CD11c+的百分比显著高于2′3′-cGAMP处理组(22.2±0.96% vs 15.6±1.39%)，表明Si9GM更有效地促进抗原呈递。Si9GM还显著提高了CCR7+DCs的比例(42.6±1.31%)，相比于2′3′-cGAMP处理组(22.5±1.91%)，显示了Si9GM在DC激活、淋巴结归巢和免疫反应增强中的优越性能。

5.Si9GM的生物分布及其对淋巴结的选择性招募

淋巴结是大多数免疫细胞聚集的重要靶点，因此纳米疫苗需要有效递送至淋巴结，以在癌症免疫治疗中建立和激发强大的免疫反应。为验证Si9GM的淋巴结归巢能力，我们将cFAET标记的2′3′-cGAMP加载至Si9GM，并与自由形式的cFAET标记2′3′-cGAMP进行比较，皮下注射小鼠后检测荧光强度。12小时后，小鼠的腹股沟淋巴结显示出最高的荧光强度，而自由形式的STING激动剂在2天内几乎没有荧光信号，表明Si9GM更倾向于积聚在腹股沟淋巴结。此外，免疫荧光染色显示Si9GM与T细胞共定位，确认了其作为人工抗原呈递细胞，促进了DC与T细胞的相互作用。

6. Si9GM增强了cDC1的激活和CD8T细胞的初始启动

cDC1在交叉呈递外源性和内源性抗原、激活T细胞以及产生记忆和效应T细胞方面非常擅长。研究表明，Si9GM纳米疫苗在肿瘤模型中显著增加了cDC1的招募、抗原交叉呈递能力和CD8+T细胞的激活。与2′3′-cGAMP和未治疗组相比，Si9GM处理组显示出更高的抗原特异性CD8+T细胞比例和细胞毒性T细胞(IFN-γ+CD8+)，表明Si9GM是一种有效的递送系统，能够增强抗原呈递和T细胞激活，用于癌症免疫治疗。

7.Si9GM联合αPD-1免疫检查点抑制剂(ICB)在体内抑制黑色素瘤生长

在黑色素瘤小鼠模型中，我们研究了Si9GM与αPD-1免疫检查点抑制剂的联合抗肿瘤效果。将B16-OVA细胞注入C57BL/6小鼠后，将小鼠随机分为6组，每组5只。肿瘤生长7天后(20–30mm3)，对小鼠进行不同处理，包括Si9GM和2′3′-cGAMP的皮下注射。24小时后，将αPD-1抗体(每次100μg)腹腔注射到Si9GM处理的小鼠中。治疗期间，每3天重复注射4次。

治疗结束后，Si9GM组的小鼠肿瘤生长显著抑制，生存率提高。与之相比，单独使用2′3′-cGAMP或SiGM的疗效较差。Si9GM联合αPD-1显著降低了肿瘤体积，而仅使用αPD-1的疗效有限。肿瘤和淋巴器官分析显示，Si9GM与αPD-1联合治疗能显著增加成熟DC(CD11c+CD80+CD86+)及细胞毒性CD8+T细胞和辅助T细胞(CD3+CD4+)，且αPD-1抗体减少了T细胞衰竭。

Si9GM治疗还显著提高了特异性SIINFEKLCD8+T细胞的比例，且在Si9GM+αPD-1组中更为明显。H&E染色和免疫荧光染色显示，Si9GM及其联合治疗显著抑制了肿瘤细胞增殖，并增加了CD8+T细胞的存在。ELISA分析结果表明，Si9GM与αPD-1联合治疗显著提高了IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-2的水平，说明其在黑色素瘤治疗中的有效性。特别是，Si9GM组的IFN-β浓度显著高于对照组，证实了STING激活引发的I型IFN的大量产生。

8. Si9GM在肺转移抑制中的作用及NK细胞的作用

尽管纳米疫苗在癌症免疫疗法中取得了显著进展，转移到远处器官的挑战仍然存在。本实验中，我们评估了Si9GM联合αPD-1阻断在抑制肺转移方面的效果。C57BL/6小鼠在接种肿瘤细胞后接受了不同的治疗。结果显示，Si9GM和Si9GM与αPD-1联合治疗显著抑制了肺转移，相比之下，未处理组、αPD-1单独治疗组及2′3′-cGAMP组显示了广泛的转移灶。通过流式细胞术分析发现，Si9GM治疗组的IFN-γ分泌的NK细胞显著增加，这表明NK细胞在防止癌细胞转移中发挥了关键作用。NK细胞的去除导致肺转移灶数量增加，而去除CD8+T细胞对治疗效果影响不大，强调了NK细胞在抑制肺转移中的重要性。这可能与Si9GM疫苗通过STING途径激活树突状细胞，进一步增强NK细胞功能相关。

9. 结论

在本研究中，我们提出了一种有前景的基于树突状细胞(DC)的纳米疫苗，选择性靶向cDC1，以增强STING通路的激活和I型干扰素(IFN)的产生，从而实现有效的癌症疫苗免疫治疗。利用cDC1在抗原交叉呈递和细胞毒性T淋巴细胞激活中的独特能力，我们开发了一种新型纳米疫苗配方，该配方使用具有中心-辐射孔结构的大孔径树枝状硅纳米颗粒，携带不同尺寸的αCLEC9A-OVA257-264结合物和STING激动剂，并涂覆了含有CLEC9A抗体和抗原肽的BMDC衍生膜。αCLEC9A结合的DC膜将纳米疫苗引导至cDC1s，而αCLEC9A-OVA257-264可以避免溶酶体降解和早期释放抗原的损失。值得注意的是，2′3′-cGAMP刺激I型干扰素的产生，导致强效的CD8+特异性抗原交叉呈递和有效的免疫反应。基于DC的纳米疫苗Si9GM与αPD-1阻断剂协同作用，有效抑制了B16-OVA肿瘤的进展和转移，且无明显副作用。令人印象深刻的是，Si9GM与αPD-1ICB的组合可以调节巨噬细胞极化，抑制Tregs，并启动持久的免疫记忆。Si9GM的效力克服了现有活细胞疫苗的不足，如免疫原性有限、病原风险、储存挑战，并继承了基于DC的疫苗的优点。总体而言，这项工作首次展示了将多孔无机纳米颗粒和APC衍生膜结合的纳米疫苗，能够选择性靶向cDC1亚群，激发强烈的STING激活，并促进强效的抗原交叉呈递，从而推动高效的个性化癌症免疫治疗。

本研究得到了韩国国家研究基金会(NRF)的资助，该基金由韩国政府(MSIT)提供(资助编号：RS-2024-00352440和NRF-2019R1A5A2027340)。

The title of the article is “STING-activating dendritic cell-targeted nanovaccines that evoke potent antigen cross-presentation for cancer immunotherapy ” 

DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.09.002

翻译：胡瑞，温州医科大学

校稿：沈建良，温州医科大学