本文提出为了在手术后调节应用于骨、软骨和牙科再生医学复合生物材料所产生的炎症反应，将糖酵解抑制剂掺入复合材料中，通过控制糖酵解通量减少了促炎性免疫细胞群并增加了植入的复合材料周围的促再生免疫细胞群，增强骨蛋白整合和血管生成，改善骨再生。总之，通过靶向免疫代谢控制对生物材料复合物的促炎反应，从而创造促再生微环境，是组织工程中的一个重大进展。
01
引言
由聚乳酸(PLA)和羟基磷灰石(HA)组成的复合生物材料常用于骨、软骨和牙齿再生工程的临床应用。PLA与HA的组合克服了HA的脆性，同时增加了聚合物的拉伸模量和硬度，并且70%(按重量计)的骨组织是HA，HA具有生物活性，可以促进新骨、软骨和牙齿组织的形成。研究表明，HA的加入或涂层可增强骨-种植体整合(骨整合)，而增强的骨整合已被证明可以降低植入物失败的风险，从而延长全膝关节和髋关节置换术的寿命。
最近的研究表明，PLA降解的水解副产物通过改变细胞生物能量学和显著增加糖酵解通量(活性)来激活周围的免疫细胞，从而导致生物材料微环境的代谢重编程。以依赖于CCR2和CX3CR1信号传导的方式，免疫代谢信号调节循环单核细胞向PLA生物材料微环境的迁移。因此，使用抑制剂如氨氧基乙酸(a.a.)或2-脱氧葡萄糖(2DG)可有效调节植入PLA的异物反应，如中性粒细胞募集减少、辅助性T细胞2和γδ+T细胞产生IL-4增加以及单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞群偏向促再生表型。这两种抑制剂在糖酵解的不同步骤起作用;a.a.抑制糖酵解底物的摄取和谷氨酰胺代谢，2DG抑制糖酵解途径中的己糖激酶。
与单独的PLA相比，HA的掺入通过以下方式发挥免疫调节作用：a)降低促炎性因子的相对水平，(CD86+CD206-)树突状细胞(DC)，包括表达II类主要组织相容性复合物(MHCII)的促炎DC;B)增加过渡的相对水平(CD86+CD206+)和抗炎或促再生(CD206+)DC，包括表达MHCII的DC;c)降低促炎单核细胞和巨噬细胞相对于生物材料微环境中过渡细胞群体的相对水平。总的来说，这些免疫调节作用能够在骨骼组织再生过程中增强骨整合和血管生成，其中过渡免疫细胞发挥关键作用。然而，单独的HA或作为与PLA的复合物长期活化中性粒细胞，抵消其有益的免疫作用。因此，当应用包含HA和PLA的散装复合植入物时，短期研究比长期(>2年)研究更有可能报告有益的免疫调节作用。此外，已知HA的磨损颗粒(来自全膝关节和髋关节置换术中应用的涂层金属植入物)会导致慢性炎症，导致植入物失效，这一过程受颗粒尺寸和形态的影响。
尽管上述体外和体内证据表明HA和HA与PLA的复合物可能发生不良免疫应答，但尚未探索相应的免疫调节策略。此外，虽然大多数先前的研究都集中在HA颗粒的炎症基础上，但尚未解决开发散装HA复合材料的免疫调节策略。在这里，通过将糖酵解抑制剂掺入由无定形聚乳酸(aPLA)和HA(aPLA+HA)组成的复合材料中来调节糖酵解通量被证明导致糖酵解通量降低，促再生植入物微环境，抑制不同的糖酵解步骤降低了促炎信号的比例，并增加了植入PLA-HA复合生物材料周围微环境中促再生CD45+免疫细胞群的相对水平。在aPLA+HA复合材料中掺入糖酵解抑制剂后，Ly6G+嗜中性粒细胞群体减少。虽然募集的CD11b+单核巨噬细胞和F4/80+组织巨噬细胞的总体水平不会随着在aPLA+HA复合物中加入糖酵解抑制剂而降低，但这些群体的相应促炎比例降低。此外，通过在植入的PLA-HA复合物中掺入糖酵解抑制剂，树突状细胞群体减少。通过掺入糖酵解抑制剂，在树突状细胞和表达MHCII的树突状细胞中精氨酸酶1水平增加。使用糖酵解抑制剂控制对生物材料复合材料的炎症反应是一项重大进步，可通过产生促再生微环境来增强骨整合和血管生成，从而改善组织再生。
结果和讨论
观察到代谢改变在聚乳酸异物反应中发挥的关键作用后，假设局部改变复合生物材料微环境中的免疫代谢信号将调节不良炎症反应。为了检验这一假设，使用或不使用含孔氨氧乙酸(a.a.)的aPLA+HA生物材料或2-脱氧葡萄糖(2DG)皮下植入C57BL/6J小鼠。作为参考，在没有生物材料植入的情况下制作切口的假手术对照。
植入后6周通过苏木精和伊红染色进行的初步观察显示，植入生物材料附近有细胞浸润(图1a)。浸润细胞表达了多种免疫细胞标志物，包括CD11b、CD86和CD206(图1b)。在表征了各种类型的聚乳酸的理化性质和降解特征后，使用aPLA，因为与半结晶制剂相比，其降解更快，以更好地模拟本文体内研究所选持续时间内的炎症反应。
图1.无定形聚乳酸-羟基磷灰石复合植入物微环境的组织学评价
尽管aPLA+HA的植入增加了总体有核造血(CD45+)细胞群，但2DG不降低CD45+水平(图2a-e)。为了了解极化的CD45+群体的相对水平，将促炎性亚群指定为CD86+CD206-，将抗炎性亚群指定为CD206+。相对于假手术对照，促炎性CD45+细胞相对于抗炎性CD45+细胞的倍数变化升高(图2f)。然而，并入a.a.或2DG与单独的aPLA+HA相比降低了促炎性CD45+比例(图2f)。有趣的是，aPLA+HA的植入降低了抗炎性CD45+细胞相对于促炎性CD45+细胞的倍数变化，这可能是由于复合生物材料的聚丙交酯含量。相比之下，并入a.a.或2DG相比于仅aPLA+HA增加抗炎性CD45+水平(图2g-k)。此外，纳入a.a.倾向于增加表达精氨酸酶1(Arg1+)的CD45+细胞的频率，即使该趋势在统计学上不显著(图2l)。
图2.无定形聚乳酸-羟基磷灰石复合生物材料微环境中的糖酵解抑制改变了招募的有核造血细胞群的数量和炎症状态
先前，观察到相对于单独的aPLA，aPLA+HA不减少募集到生物材料微生物环境的Ly6G+嗜中性粒细胞。在此，发现表明与假手术对照相比，aPLA+HA植入升高了中性粒细胞水平(图3a_e)。值得注意的是，将a.a.或2DG调节了这种促炎倾向(图3a-e)。中性粒细胞水平升高在植入微米级HA颗粒的鼠骨缺损中普遍存在，使用纳米级HA颗粒可降低这种效应。中性粒细胞水平降低与促再生巨噬细胞表型相关，这是驱动骨再生所必需的。这一观察结果具有预防相关性，因为HA在体外可有效激活人中性粒细胞。
图3.代谢抑制剂的掺入调节无定形聚乳酸-羟基磷灰石复合生物材料微环境中的中性粒细胞募集
接下来，检查了生物材料微环境中CD11b+单核细胞和F4/80+巨噬细胞的水平(CD11b也在一些B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞上表达)。与先前的观察结果一致，相对于假手术对照，aPLA+HA的植入增加了单核细胞和巨噬细胞的比例，但a.a.或2DG没有减少细胞募集(图4a-f)。据观察，相对于假手术对照，aPLA+HA增加了单核细胞(图4g)和巨噬细胞(图4h)中的Arg1水平，这可能是由于其免疫调节能力。此外，a.a.而不是2DG与aPLA+HA的联合作用倾向于进一步增加单核细胞和巨噬细胞中的Arg1水平，尽管这种趋势在统计学上不显著(图4g和h)。相对于假手术对照，aPLA+HA增加了促炎性单核细胞相对于抗炎性单核细胞的倍数变化;然而，a.a.或2DG降低促炎原水平(图5a)。尽管植入aPLA+HA降低了抗炎单核细胞向促炎性炎症单核细胞的倍数变化，但a.a.增加抗炎比例没有统计学显著性(图5b-f)。与用单核细胞进行的观察类似，与假手术对照相比，aPLA+HA升高了促炎性和降低了抗炎性巨噬细胞水平(图5g-j)。当a.a.或2DG降低了促炎巨噬细胞水平，抗炎水平没有增加，如在定量数据和代表性点图中所观察到的(图5g-1)。
图4.在无定形聚乳酸-羟基磷灰石复合生物材料微环境中，靶向不同的糖酵解步骤对单核细胞和巨噬细胞种群的影响不同
图5.在无定形聚乳酸-羟基磷灰石复合生物材料微环境中，单核细胞和巨噬细胞的活化状态受到糖酵解抑制的调节
如前所述，观察到与假手术对照相比，在aPLA+HA微环境中CD11c+树突状细胞群升高，并且a.a.或2DG减少了这些树突细胞的数量(图6a-e)。有趣的是，与假手术对照相比，在aPLA+HA植入物的微环境中，促炎性树突状细胞相对于抗炎性树突状细胞的倍数变化增加；然而，a.a.或2DG不降低促炎树突细胞水平(图6f)。此外，尽管与假手术对照相比，在aPLA+HA中抗炎树突细胞至促炎树突细胞的倍数变化降低，但掺入a.a.或2DG没有增加抗炎树突细胞的比例(图6g)。
相对于假手术对照，在植入aPLA+HA后，树突细胞中Argl的表达增加(图6h-j)。值得注意的是，与aPLA+HA相比，掺入a.a.树突状细胞群中Arg1表达进一步升高(图6h-1)。表达MHCII的树突细胞在假手术组和aPLA+HA组之间是相似的;当与aPLA+HA相比时，掺入2DG减少了表达MHCII的树突细胞的数量(图6m)。与假手术对照相比，aPLA+HA既增加了表达MHCII的树突状细胞的促炎比例，又降低了其抗炎比例(图6n-o)，揭示了复合生物材料驱动促炎状态的先前未被认识到的机制。与仅aPLA+HA相比，a.a.在表达MHCII的树突状细胞中Arg1表达升高(图6p-t)。复合生物材料微环境中Arg1表达的增加可能是由于a.a.，其避免了免疫细胞进入促炎状态的代谢和转录激活。升高的Arg1是骨诱导的关键驱动因素，创造了促再生复合生物材料微环境。有趣的是，观察到的免疫调节作用可能是由少于6%的释放药物引起的(图7a和B);释放的a.a.可能是由于所用的质谱技术不能测量a.a.<0.078μM。此外，药物释放研究显示，200mg丸剂中存在的总药物含量(平均值±SD，n=3)为131.51±15.91nga.a.或243，070.90±26，451.18ng。
图6.在无定形聚乳酸-羟基磷灰石复合生物材料微环境中，树突状细胞的比例和炎症状态受到影响
总之，本研究揭示了复合生物材料影响免疫微环境的新方法，例如改变促炎性与抗炎性CD45+群体的比例。通过改变植入复合生物材料周围的糖酵解通量来控制代谢状态能够：a)减少中性粒细胞募集;B)减少促炎性单核细胞和巨噬细胞群体;c)减少树突细胞数量;d)增加树突细胞和表达MHCII的树突细胞中的Arg1表达。氨氧基乙酸(a.a.)，代谢抑制剂之一，已经在临床试验中安全地用于治疗其他疾病，使其成为可转化的抑制剂，用于掺入复合生物材料中以供未来临床使用。在临床转化之前，未来研究可能探索的当前研究的局限性包括需要表征植入含有嵌入的代谢产物的复合生物材料的影响。在肌肉骨骼组织如骨缺损中的抑制剂，用于再生医学应用。需要进行额外的研究，以表征更长的体内时间点以及代谢抑制剂对由具有不同理化性质(例如结晶度)的不同生物材料制成的复合植入物的影响，这可能会影响免疫调节作用。通过局部控制生物材料周围免疫细胞的代谢来调节对生物材料复合物的炎症反应，代表了该领域令人兴奋的进展，其可以通过产生促再生微环境来显著增强骨整合和血管生成。
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通讯作者：Chima V. Maduka
A veterinarian in biomedical engineering. His interests are in immunology, metabolism, biomaterials, drug delivery, cancer biology and regenerative medicine.
通讯作者：Christopher H. Contag
Christopher H. Contag, PhD, is the Director of the Institute for Quantitative Health Science and Engineering, and the Chair of Biomedical Engineering. Dr. Contag is the founding chair of the Department of Biomedical Engineering and inaugural director of the Institute for Quantitative Health Science and Engineering at Michigan State University. He is also professor emeritus in the Department of Pediatrics at Stanford University School of Medicine.
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这项工作的资金部分由密歇根州立大学的詹姆斯和凯瑟琳·科尼利厄斯捐赠基金提供。
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The title of the article is “Regulating the proinflammatory response to composite biomaterials by targeting immunometabolism” https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.05.046
翻译：赵蕊，温州医科大学
校稿：沈建良，温州医科大学
Bioactive Materials 创建于2016年，自2019年被SCIE检索收录以来影响因子实现跳跃式增长(IF 2019: 8.724；IF 2020: 14.593；IF 2021: 16.874；IF 2022:18.9; IF 2023: 18)；JCR materials science, biomaterials 领域国际排名连续四年第一。此外， 2020年到2023年连续四年入选中国科学院文献情报中心期刊分区表一区，Top期刊；入选材料科学综合类高质量科技期刊分级目录T1区。
