针对金黄色葡萄球菌骨感染病灶中难治性葡萄球菌脓肿群落(SACs)和骨细胞腔隙小管网络(OLCN)内定植细菌，重庆医科大学附属第二医院骨科邓忠良/任有亮/楚磊研究组联合中国科学院深圳先进研究院崔旭副研究员创新设计了硼硅酸盐生物活性玻璃(BSG)与Fe₃O₄磁性纳米颗粒支架。结合交变磁场下的磁热抗菌与BSG降解的微环境，该支架表现出优异的体内外抗菌效用与介导宿主免疫反应促进成骨的协同功能，该方法有望对临床抗骨感染非药物治疗策略的开发提供新思路。
01
1. 研究背景
骨感染是骨科灾难性并发症之一，具有难治疗、易复发和治疗周期长等特点。近年来，重庆医科大学附属第二医院邓忠良教授团队与美国罗切斯特大学医学中心合作开展有关骨感染临床流行病学、创伤术后骨感染复发机制及其临床转化医学的研究。该团队前期通过回顾性分析既往10年中国地区21家“三甲”医院四肢创伤性骨感染患者的临床、手术及病理资料，分析了中国区域内引起创伤性骨感染的主要菌群及其耐药菌谱的动态变化，明确了金黄色葡萄球菌是导致难治性骨感染的最主要致病菌(Youliang Ren, et al. Internation Journal of Surgery. 2023)。同时揭示了金葡性骨感染难治疗的主要原因在于：细菌生物膜存在的多样性、葡萄球菌脓肿群落(SACs)的形成和细菌在骨细胞腔隙小管网络(OLCN)内定植(Youliang Ren, et al. Bone Research. 2023)。尽管临床常规标准化治疗策略(包括清创术、系统性或局部抗生素使用)可有效清除感染病灶内浮游细菌，但对包裹在生物膜内的金葡菌作用极为有限。为此，本研究团队基于Fe₃O₄磁性纳米颗粒的体内外生物安全性与高效磁热抗菌性能(Youliang Ren, et al. Advanced in Nano Research, 2022)，并结合硼硅酸盐生物活性玻璃(BSG)优异生物降解、免疫调控与成骨诱导活性，创新性设计开发了一种BSG+Fe₃O₄磁性纳米颗粒支架(后续简称磁热生物活性支架)，并通过系列体内、外研究探索该磁热生物活性支架对复杂金葡菌骨感染抗菌作用、骨诱导特性、生物安全性(图1)。
研究发现：该磁热生物活性支不仅可有效清除骨感染病灶髓腔内SACs和OLCN中定植的细菌，同时可以促进感染性骨缺损修复(图1)，该研究成果有望对临床难治性金黄色葡萄球菌性骨感染提供一种新颖的辅助治疗思路。
图1. BSG+Fe₃O₄磁热生物活性支架治疗金黄色葡萄球菌相关骨感染模型的示意图
2. 重要研究结果
本研究根据构建植入物相关骨感染动物模型所用钛合金螺钉尺寸(图2)，制备不同BSG/Fe₃O₄质量配比的磁热生物活性支架。SEM结果显示Fe₃O₄磁性纳米颗粒可均匀分布在BSG基质中，不影响其微观结构。FTIR和XRD分析表明Fe₃O₄成功整合且未改变BSG无定形结构，磁热生物活性磁热生物活性支架在PBS中浸泡后可发生降解但结构稳定。生物力学结果显示支架抗压强度随Fe₃O₄质量比增加而增强，接近成人松质骨强度。表明磁热生物活性支架具有承受类似于人体骨组织的机械应力荷载。
图2. BSG+Fe₃O₄磁热生物活性支架的形态表征及生物力学性能检测
同时，通过ALP染色和茜素红染色证实稀释128倍的磁热生物活性支架提取物可促进骨髓间充质干细胞(MSCs)中的碱性磷酸酶(ALP)表达和晚期基质矿化，并上调成骨相关基因RUNX2、ALP、OCN的表达，且BSG+5%Fe₃O₄组磁热生物活性支架浸提液作用最显著(图3)。
图3. BSG+Fe₃O₄磁热生物活性支架浸提液对MSCs成骨作用影响
此外，通过RNA转录组测序发现该磁热生物活性支架浸提液可显著增强MSCs对病毒和细菌免疫反应的基因表达以及与MSCs的成骨分化、细胞外基质分泌和骨组织矿化相关基因表达(图4)。同时，磁热生物活性支架浸提液还可促进MSCs趋化因子受体如CCR2相关的炎症介导途径基因的表达，提示该磁热生物活性支架在免疫调节和成骨作用方面的优势潜能。KEGG富集分析进一步确认了支架可上调与NOD样受体(NLR)和TNF信号通路相关的基因表达，强调了其在骨免疫和骨稳态调节中的作用。
图4. 转录组测序证实BSG+5%Fe₃O₄组磁热生物活性支架浸提液可上调MSCs对细菌的免疫应答并促进MSCs成骨分化和趋化因子受体基因表达
同时，通过流式细胞术证实该磁热生物活性支架可显著降低M1型炎症标志物CD80表达，但可促进M2型标志物CD206表达，同时促进抗炎基因(TGF-β1、IL-1Ra)表达增加、抑制促炎基因(IL-6、IL-1β)表达(图5)，提示Fe₃O₄磁性纳米颗粒的掺入可增强BSG单体的抗炎能力，同时具有降低巨噬细胞炎症反应程度的作用，此发现为未来将磁热生物活性支架用于骨再生和免疫调节领域进行深度研究提供初始证据。
图5. 流式细胞术证实该磁热生物活性支架对巨噬细胞具有免疫调节作用
研究人员将BSG+5%Fe₃O₄组磁热生物活性支架置于恒定交变磁场(AMF)中作用180秒后通过红外热成像仪采集支架表面温度，发现BSG+5%Fe₃O₄磁热生物活性支架在AMF下暴露180秒时，支架表面温度可达到54.7±1.1℃(图6)，这一温度高于已知的有效灭菌温度(45℃)，且不会损害宿主组织。在距磁热生物活性支架中心平均0.1155mm的径向距离内均可达到有效灭菌温度，温度最低可维持在45℃。
图6. 磁热生物活性支架在AFM中磁热作用3min后温度变化及体外抑菌作用检测
基于所掌握磁热生物活性支架的体外抑菌作用，研究人员通过构建新西兰大白兔植入物相关金葡菌骨感染动物模型(图7A)，进一步检测该磁热生物活性支架在体内抑菌性能。研究人员将金葡菌污染性钛合金螺钉植入到新西兰大白兔胫骨中1周后建立植入物相关金葡菌骨感染，在感染形成7天后对所有大白兔感染性胫骨进行标准化清创，而后将标准尺寸的磁热生物活性支架植入到感染性骨缺损部位连续治疗6周，通过采集纵向时序上组织大体学和影像学(CT图像)证据，研究人员发现与单纯BSG+5%Fe₃O₄相比，BSG+5%Fe₃O₄磁热生物活性支架在AMF中展现出优异的抗菌活性，主要表现在磁热生物活性支架治疗后实验动物的组织大体学局部未见明显感染性脓苔、影像学显示骨膜反应降低、未见到明确的骨质破坏和感染性骨溶解(图7)。
图7. 组织大体学和影像学证实磁性对新西兰大白兔植入物相关金葡菌骨感染模型的治疗效果
通过在感染性胫骨进行组织学切片、染色(图8)，研究人员发现在金葡菌污染性螺钉植入7天后且经过标准化清创术后，新西兰大白兔胫骨髓腔中仍可见到金葡菌定植于SAC和OLCN中，提示清创术并不能彻底清除骨感染病同时，研究人员发现BSG+5%Fe₃O₄组磁热生物活性支架在AMF中展现出优异的抗菌活性和骨诱导特性，且局部未见明显不良反应。
图8. 组织学证实磁性BSG+5%Fe₃O₄组磁热生物活性支架在交变磁场作用下可有效清除骨感染病灶内SACs和OLCN中定植金葡菌并促进病灶周围新骨形成
3. 结论
本研究所设计磁性BSG+5%Fe₃O₄磁热生物活性支架在AMF作用下不仅可有效清除骨感染病灶内SACs和OLCN中定植金葡菌、发挥优异抑菌效果，还可促进感染病灶周围的新骨形成、修复感染性骨缺损。因此，基于本研究所掌握该磁热生物活性支架优异的力学性能、可降解性、杀菌活性、骨诱导和免疫调节性能以及低毒性，该磁热生物活性支架未来有望为临床植入物相关金葡菌骨感染的治疗提供新思路。
02
第一作者：金瑛
重庆医科大学附属第二医院骨科2021级博士研究生。现于遵义医科大学附属医院骨科工作，主要从事骨感染及其免疫治疗等相关研究。
第一作者：刘航
重庆医科大学附属第二医院骨科2021级硕士研究生。从事骨感染及间充质干细胞成骨分化方面相关研究。
第一作者：楚磊
医学博士，医学博士后，副主任医师，博士后合作导师。重庆医科大学附属第二医院骨科-脊柱外科中心副主任、疼痛科副主任(主持工作)。重医附二院宽仁英才项目—骨干人才，重庆市中青年医学高端人才，2022年获重庆市中青年医学高端人才工作室。2013年开始，在全国300余家医疗单位进行脊柱内镜技术推广，培养了全国各地微创技术人才200余人。多次去德国、韩国、日本、新加坡、泰国、中国台湾等地进行国际交流及培训。主要从事脊柱退行性疾患的微创治疗及慢性疼痛的介入治疗。
通讯作者：邓忠良
主任医师、教授，博士/博士后导师。国家卫生部突出贡献中青年专家，重庆市外科学(骨科)学术技术带头人，国务院政府特殊津贴。中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志、中国骨质疏松杂志、中国脊柱脊髓杂志重庆医学杂志等编委，“5+3”《运动系统疾病》教材主编。先后赴美国芝加哥大学、北卡罗来纳大学进行访问学者研究及参观学习，并多次赴德国和在美国Twin Cities Spine Center、Atlantic Spinal Care等脊柱中心等学习微创脊柱外科技术，带领团队率先开展了多项国内外领先的微创脊柱外科技术。长期从事老年骨质疏松、骨病等的临床和相关骨再生与调控基础研究工作。主持国家自然科学基金等各类项目近20项。作为主要作者发表在Nature Protocols、J Cell Biology、Biomaterias、Bioactive Materials等杂志超50篇，获得重庆市科技进步二等奖和中华医学二等奖各1项。
通讯作者：任有亮
医学博士，美国罗切斯特大学、重庆医科大学双博士后，贵州省人民医院2024年高层次引进人才。国际华人骨研学会2024年度优秀青年学者奖获得者；获美国骨科研究学会(ORS)2023优秀青年学者提名奖、2024年Animal Model section 3R奖提名；获罗切斯特大学骨科研究中心2021-2023优秀博士后提名。先后主持国家博士后自然科学基金项目、博士后国际培养交流计划等3项；作为主要完成人参与NIH资助项目5项。发表SCI收录专业论著20余篇，其中近三年以第一或通讯作者在Nature Journal-Bone Research、Bioactive Materials, International Journal of Surgery等Q1期刊发表论文10余篇；参与起草2023年国际骨感染专家共识。近三年受邀在ORS年会、瑞士AO Research Institute (ARI)等国际专业学术会议进行主题发言10余次。担任Journal of Orthopaedic translation青年编委，是Journal of Orthopaedic Research等6种杂志审稿人。主要研究领域包括：1)骨折修复及组织工程学、2)骨感染临床流行病学研究、3)骨感染靶向抗生素研发及免疫治疗4)骨感染组织工程学修复材料的研发与应用等。
通讯作者：崔旭
工学博士，副研究员/副教授，医疗器械高级工程师，博士生导师，中国科学院深圳先进技术研究院医药所人体组织与器官退行性研究中心微环境调控组织再生及其产业转化课题组PI，“鹏城孔雀计划”特聘C类人才。现任深圳理工大学药学院科研副教授，兼任深圳市中科海世御生物科技有限公司研发总监。崔旭教授一直从事于骨与创伤的修复重建、骨与关节病发病机理及相关骨组织再生机制研究工作，先后开发了生物活性玻璃基的多孔支架、复合水凝胶、药物载体、骨水泥、纤维等，用于骨、软骨和皮肤创伤等的修复重建。目前，相关研究已在AdvSci、BioMater、ACS Appl. Mater. Interfaces、Mater. Sci. Eng. C等期刊发表相关论文20余篇，申请国家发明专利20余项，其中已获得授权专利8项。目前主持国家自然科学基金委项目2项，广东省自然科学基金项目1项；合作申请国家自然科学基金委联合重点项目2项。牵头6款骨与创伤医疗III类医疗器械、3款II类和I类器械等的产业研发，目前1款三类器械已经完成临床试验病例入组，1款III类器械开展临床。在国际和国内学士会议报告20余次。
此外，本研究团队在此诚挚感谢：1、中国科学院深圳先进技术研究院潘浩波教授及团队对本研究所使用生物活性玻璃的提供及性能检测；2、上海市第六人民医院郑元义教授对本研究涉及磁热内容的指导。
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该研究获国家重点研发计划(2023YFC2416900和2021YFC2400500)、重庆市国际博士后交流项目(2021JLPY004)、中国博士后科学基金(2021M693758)、国家自然科学基金(U22A20357、 52072398和32161160327)，重庆市自然科学基金博士后科学基金项目(cstc2021jcyj-bsh0019)，重庆市自然科学基金项目(cstc2021jcyj- msxmX0134)，深圳市科技计划项目(JCYJ20230807140714030)的支持。
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Jin Y, Liu H, Chu L, Yang J, Li X, Zhou H, Jiang H, Shi L, Weeks J, Rainbolt J, Yang C, Xue T, Pan H, Deng Z, Xie C, Cui X, Ren Y. Initial therapeutic evidence of a borosilicate bioactive glass (BSG) and Fe₃O₄ magnetic nanoparticle scaffold on implant-associated Staphylococcal aureus bone infection. Bioact Mater. 2024 Jun 8;40:148-167. doi: 10.1016/j.bioactmat.2024.05.040. PMID: 38962659; PMCID: PMC11220464.
Bioactive Materials 创建于2016年，自2019年被SCIE检索收录以来影响因子实现跳跃式增长(IF 2019: 8.724；IF 2020: 14.593；IF 2021: 16.874；IF 2022:18.9; IF 2023: 18)；JCR materials science, biomaterials 领域国际排名连续四年第一。此外， 2020年到2023年连续四年入选中国科学院文献情报中心期刊分区表一区，Top期刊；入选材料科学综合类高质量科技期刊分级目录T1区。
