第四军医大学魏洪波教授和西北工业大学李鹏教授、王腾蛟副教授在科爱创办的期刊Bioactive Materials上联合发表研究论文：本课题针对种植体周围软组织结合(STI)较天然牙弱，导致种植体周围炎症发病率高，影响了种植成功这一难题。利用贻贝仿生化学技术，创新性地将热敏性一氧化碳(CO)供体通过左旋多巴和交联剂 PETMP 结合到钛表面形成一种仿多肽的双功能 CO 气体信使涂层(Ti‑DOPA‑CO)。该涂层制备简单、实用性强，且亲水性能优异，还有具有一定光热性能。利用其光热性能结合负载的热敏性 可实现 NIR 激活的 CO 控释， 从而发挥抗菌和巨噬细胞调控功能，并最终促进种植体周围 STI。该涂层的开发为降低种植体周围生物学并发症发生率提供了新策略，具有较大的临床意义。此外，课题基于单细胞测序和体内外实验结果，提出了 Ti‑DOPA‑CO 作用于通过巨噬细胞调控增强 STI 的可能机制，为后续 STI 相关研究提供了实验和理论支持。
01
种植体周围牢固稳定的软组织结合(STI)是保护种植体 免受口内细菌侵袭等外界因素刺激的屏障，对预防感染发生、维持种植体长期稳定起到关键作用。种植体周围 STI 的破坏容易引起一系列种植生物学并发症，严重影响了种植体长期成功。然而，与天然牙相比，种植体周围 STI 要弱得多。因此，如何增强种植体周围 STI，从而降低种植体生物学并发症的发生是亟待解决的问题。 过去增强种植体周围 STI 的研究多集中于促进种植体表面抗菌性能以及促细胞粘附性能。近年来，种植体周围免疫微环境调控逐渐受到重视，也是促进和维护种植体周围 STI 的关键策略。作为三大气体信使之一，一氧化碳(CO)被认为是人体内 重要的内源性信号分子，在免疫调控、抗炎、抗菌和细胞保护方面显示出广泛的应用价值，且较其他气体信使更为稳定，利于生物应用。目前已经有多种CO释放分子(CORMs)被研发，能够方便安全地在局部携带并递送CO发挥治疗作用。本研究采用贻贝启发化学方法将热敏性CORMs:十二羰基三铁(Fe3(CO)12)固定在钛表面，利用涂层的光热性能结合负载的热敏 CORMs 可实现 NIR 激活的CO控释，形成具有抗菌和巨噬细胞调控功能的CO气体信使涂层，以增强种植体周围STI，为提高种植体长期成功提供解决方案(图1)。
图1：钛表面一氧化碳气体信使涂层通过抗菌和调控巨噬细胞促进软组织。
贻贝启发的表面化学修饰是构建钛表面涂层最使用高效的方法之一，含有邻二苯酚的物质能通过氧化自聚附着在几乎所有固体表面，本课题利用贻贝仿生化学技术，将热敏性 CORMs:Fe3(CO)12、左旋多巴(L-DOPA)和交联剂 PETMP 结合到钛表面形成一种仿多肽的CO气体信使涂层。与 Ti 组相比，Ti‑DOPA‑CO 表面粗糙度更大，亲水性明显增强。Ti‑DOPA‑CO 具有一定的光热性能，在NIR照射10 min中后，在PBS中的温度上升到42.5°C。Ti‑DOPA‑CO 在密闭环境中能够缓慢释放微量CO达 12 h 以上。在液体 环境中，涂层能够响应 NIR 照射快速释放CO，同时还能响应 NIR 间歇性照射实现 循环响应CO释放(图2)。
图2：Ti‑DOPA‑CO的制备与表征。A)仿多肽CO释放涂层的制备示意图。B)Ti、Ti、Ti-DOPA的SEM图像。C)对Ti、Ti‑DOPA、Ti‑DOPA‑CO的AFM分析。D)在NIR(1.0 W/cm2)照射下Ti‑DOPA‑CO的实时热成像图。E)使用CO荧光探针系统(FL‑CO‑1 + PdCl2，各5μM)在 NIR+和 NIR-条件下Ti‑DOPA‑CO释放CO的荧光光谱。F)Ti‑DOPA‑CO 的循环 NIR 响应CO释放结果。
在体外抗中评价菌选用金黄色葡萄球菌和牙龈卟啉单胞菌作为实验菌株，分别代表革兰阳性需氧菌和革兰阴性厌氧菌。通过平板涂布法对涂层表面的细菌在活率进行了定量检测;通过细菌 Live/Dead 染色对涂层表面细菌的存活情况进行定性评价; 通过 SEM 对涂层表面细菌的形态进行观察。在NIR照射下，Ti‑DOPA‑CO 对 Sa 和 Pg 均具有明显的抗菌活性， 两种细菌的存活率分别为 12.3±5.3%和 9.1±3.4%。Live/Dead 观察到 Ti‑DOPA‑CO 在 NIR 照射的条件下，抗菌性能明显增强，表面主要表现为红色荧光的死细菌。 SEM 形貌观察证实 Ti‑DOPA‑CO 涂层在 NIR 照射下能够影响对粘附于其表面的细菌形态，细菌形态出现明显皱缩和细胞膜破裂(图3)。
图3：对金黄色葡萄球菌和牙龈卟啉单胞菌的体外抗菌性能。A)在NIR+/-条件下不同组金黄色葡萄球菌培养物形成的细菌菌落图像和 B)相应的金黄色葡萄球菌存活率。C)在NIR+/-条件下不同组牙龈卟啉单胞菌培养物形成的细菌菌落图像和 D)相应的牙龈卟啉单胞菌存活率。E ) 荧光图像显示金黄色葡萄球菌和牙龈卟啉单胞菌在不同样品表面的活/死分布(比例尺 = 100 μm)。F)金黄色葡萄球菌和牙龈卟啉单胞菌在不同样品表面的 SEM 图像。
各组样品对成纤维细胞和巨噬细胞均具有良好的生物相容性。Ti- DOPA‑CO 能够促进 LPS 刺激的 M1 型巨噬细胞向 M2 型巨噬细胞的表型转换。与 Ti 和 Ti‑DOPA 组相比，Ti‑DOPA‑CO 产生CO能有效地抑制巨噬细胞分泌促炎因子(TNF‑α、IL‑6)，并刺激巨噬细胞的促生长因子(IL‑10、TGF‑β)的分泌(图4)。与 Ti 组相比，Ti‑DOPA‑CO 能够促进成纤维细胞 增殖、黏附，并且支持细胞骨架形成(图5)。
图4：体外抗炎和免疫调节能力评价 A)NIR 触发CO生成的抗炎和免疫调节示意图。B、C)不同处理后 RAW264.7 标记物的荧光染色图像(红色：CD86或 CD206，蓝色：细胞核；比例尺 = 20 μm)。D)不同处理后正常和 LPS 诱导的巨噬细胞分泌的促炎细胞因子(TNF‑α 和 IL‑6)和抗炎细胞因子(TGF‑β 和 IL‑10)的ELISA分析。
图5：Ti-DOPA-CO 上成纤维细胞的细胞行为。A) NIH3T3 在第 1、3 和 5 天在各组样品上的活/死染色图像。B) Alamar Blue 测定的荧光强度显示NIH3T3 在第 1、3 和 5 天的细胞活力。C) NIH3T3 在各组样品上培养 2、6 和 24 小时后DAPI免疫荧光染色结果。D) 对 2、6 和 24 小时时接种在不同基质上的细胞数量进行定量分析。 E) 在不同基质上培养 24 小时的 NIH3T3 肌动蛋白细胞骨架通过鬼笔环肽‑FITC染色结果。
体内实验中首先构建了大鼠上颌第一磨牙延迟植入模型。结果显示，种植体植入后第 1-3 天连续给予 NIR 照射触发CO大量释放发挥抗菌功能，在第 4 天时，Ti‑DOPA‑CO组种植体周围软组织中的细菌数量显著少于 Ti 组和 Ti‑DOPA组。在细菌水平得到有效控制后，种植体植入第 4 天起不再给予 NIR 光照，涂层缓慢低剂量释放CO发挥巨噬细胞调控作用，在植入后第 7 天，结果显示 Ti‑DOPA‑CO组种植体周围软组织中促炎因子水平显著降低，抗炎因子水平显著升高，炎性状态优于 Ti 组和 Ti-DOPA组。结果显示 Ti‑DOPA‑CO组种植体周围软组织中巨噬细胞从 M1 表型向 M2 表型极化(图6)。在种植体植入后 28 天，Ti‑DOPA‑CO组种植体周围上皮完整性，胶原纤维合成，STI 界面粘附蛋白均显著优于Ti组和 Ti‑DOPA 组(图7)。
图6：大鼠上颌延期种植模型中的抗菌和免疫调节实验结果。A)体内实验流程图。B)不同组别在 LB 固体培养基上形成的金黄色葡萄球菌菌落。C) 通过计数不同组别的菌落定量分析抗菌率。D) 软组织中 M1(iNOS 和 CD86)和 M2(Arg‑1 和 CD206)巨噬细胞标志物的相对mRNA 表达水平。E、F) 种植体周围软组织中 F4/80(巨噬细胞标志物)和 iNOS(M1 标志物)或 Arg‑1(M2 标志物)的免疫荧光染色(比例尺 = 50 μm)。G) iNOS 和 H) Arg-1 阳性区域/F4/80 阳性区域的半定量分析。 I) 不同组种植体周围软组织的促炎细胞因子 (TNF-α 和 IL-6) 和抗炎细胞因子 (TGF‑β 和 IL‑10) 的 ELISA 分析。
图7：体内骨整合和 STI 评估。A) 大鼠上颌骨区域(包括种植体；比例尺 = 1 毫米)的 Micro-CT 3D 重建图像。BE) Micro-CT 扫描中 BV/TV、Tb·Th、Tb·N 和 Tb. Sp 的量化。F) MT 染色(上比例尺 = 200 微米，下比例尺 = 50 微米)和 G) 相应的胶原沉积密度定量分析。H) 整合素β 4 和 I) 层粘连蛋白β 3在种植体-软组织界面的免疫荧光染色和 J、K) 相应的定量分析。MT 染色和免疫荧光染色独立重复三次，得到相似的结果。
最后通过单细胞测序分析涂层通过调控巨噬细胞功能促进 STI 的潜在机制。与 Ti 组相比，Ti‑DOPA‑CO 组中基底细胞和内皮细胞在所有细胞类别中的构成比较高。Ti‑DOPA‑CO 对种植体周围软组织中的细胞因子谱产生了调节作用，进而影响了免疫微环境中的细胞活性。在 Ti‑DOPA‑CO 组巨噬细胞差异表达基因的功能富集分析中，有三条通路与 STI 高度相关:PI3K‑Akt 信号通路，TGF‑beta 信号通 路以及 ECM 受体相互作用。Ti‑DOPA‑CO 组中成纤维细胞差异表达基因主要富集 在与 STI 密切相关的功能条目中(图8)。与 Ti 组相比，Ti‑DOPA‑CO 组周围软组织中成纤维—巨噬细胞通过 CXCL12/CXCL14/CXCR4 和 CSF1‑CSF1R 受配体相互作用显著增强(图9)。
图8：ScRNA -Seq 分析揭示了种植体周围免疫微环境的变化。A) scRNA-seq 鉴定出的主要细胞类型的 UMAP 表示。B) 点图显示每种细胞类型的前三个标记基因。C) 火山图描绘了 Ti 和 Ti‑DOPA‑CO 组之间的 DEC。D) GO分析揭示了 Ti 和 Ti‑DOPA‑CO 组之间 DEC 在生物过程(BP)、细胞成分 (CC) 和分子功能 (MF)中富集的热门术语。E) KEGG 分析表明 Ti 和 Ti‑DOPA‑CO 组之间巨噬细胞 DEG 中富集的前十大信号通路。F) 热图显示 Ti 和 Ti‑DOPA‑CO 组之间成纤维细胞的差异表达基因。 G) GO分析显示 Ti 和 Ti‑DOPA‑CO 组之间成纤维细胞中差异表达基因的 BP、CC 和 MF 富集条目。
图9：Ti-DOPA-CO 种植体周围微环境中的成纤维细胞-巨噬细胞通讯。A、B) Ti 和 Ti-DOPA-CO 组中的细胞通讯网络。边缘的颜色和宽度表示细胞类型之间的相互作用对的数量。C、D) 热图显示 Ti 和 Ti‑DOPA‑CO 组中细胞通讯的概况。E、F) 点图显示Ti-DOPA-CO 组不同细胞类型中配体-受体对的细胞相互作用。
02
第一作者
周铭浩：第四医大学口腔医院种植科、口颌系统重建与再生全国重点实验室2024级博士研究生。从事钛种植体表面改性促进软组织结合研究。
李刚锋：西北工业大学柔性电子研究院2022级博士研究生，主要研究方向为抗感染气体递送纳米生物材料。
于婧薇：第四军医大学口腔医学2018级八年制学员。从事促进种植体周围软组织结合相关研究。
通讯作者
魏洪波：第四军医大学口腔医院口腔种植科教授、主任医师，博士研究生导师，口颌系统重建与再生全国重点实验室PI、第四军医大学医学创新中心PI。长期从事种植体周围软组织封闭研究，围绕着增强种植体周围软组织封闭的三大策略——促进软组织细胞功能、抗菌及调控免疫微环境，以第一/通讯作者(含共同)发表SCI论文17篇，以第一发明人授权国家发明专利4项、实用新型专利1项。主持国家自然科学基金青年项目1项、中华医学会青年科研专项基金1项、陕西省自然科学基金2项、陕西省重点研发计划1项、全国重点实验室自主课题面上项目1项、国家口腔疾病临床医学研究中心课题1项。
王腾蛟：西北工业大学柔性电子研究院副教授、博导，主要从事一氧化氮、一氧化碳、硫化氢等气体信使递送系统的制备及其抗感染性能方面的研究工作。目前已累计发表包括Prog. Polym. Sci.、Adv. Mater.、Adv. Funct. Mater.、 NPJ Flex. Electron.、Bioact. Mater.、ACS Nano、ACS Macro Lett.等在内的SCI收录论文30余篇，申获中国发明专利12项，美国发明专利2项，撰写专著章节2章。先后主持或参与国家重点研发计划课题、国家自然科学基金青年基金、陕西省重点研发计划项目及产学研合作项目等若干项。
李鹏：西北工业大学柔性电子研究院教授、博导，现任西北工业大学柔性电子研究院副院长，西北工业大学优秀青年教师(吴亚军奖)获得者。主要从事生物医用材料与治疗器件方向研究，发表Nat. Mater.、Adv. Mater.、Chem. Soc. Rev.、ACS Nano、Adv. Sci.、Bioact. Mater. 、J. Control. Release等国际学术期刊70余篇，专著4章，申获WIPO国际专利5项(其中转让2项)，中国专利10余项。主持国家级项目5项，省部级项目10余项。获得陕西省杰出青年(2023)，“高校青年科技创新团队”(2020)，陕西省“青年科技新星”(2019)、人才计划青年学者(2018)，江苏省“双创博士”(2017)、“六大人才高峰”(2016)，“国家优秀自费留学生奖”(2013)等荣誉。
课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/li_peng
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该研究获国家自然科学基金(52073224、52073230)、陕西省杰出青年科学基金(2023-JC-JQ-32)、陕西省重点研发项目(2024SF-YBXM-438、2022SF-165)和重庆市自然科学基金(CSTB2023NSCQ-MSX0225)支持。
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Minghao Zhou, Gangfeng Li, Jingwei Yu, Qian Zhou, Kun Wang, Jiaxin Kang, Tengjiao Wang*, Peng Li*, Hongbo Wei*. Interfacial delivery of carbon monoxide via smart titanium implant coating for enhanced soft tissue integration with switchable antibacterial and immunomodulatory properties. Bioactive Materials, 40 (2024) 318-333 DOI: https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.06.010
Bioactive Materials 创建于2016年，自2019年被SCIE检索收录以来影响因子实现跳跃式增长(IF 2019: 8.724；IF 2020: 14.593；IF 2021: 16.874；IF 2022:18.9; IF 2023: 18)；JCR materials science, biomaterials 领域国际排名连续四年第一。此外， 2020年到2023年连续四年入选中国科学院文献情报中心期刊分区表一区，Top期刊；入选材料科学综合类高质量科技期刊分级目录T1区。
