陈大福、刘亚军、程晓光：成孔效应基因递送系统增强肿瘤细胞焦亡诱导骨肉瘤微环境重塑

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，预后较差，尤其高发于儿童和青少年。在过去的几十年里，患者的平均5年无事件生存率并没有显著提高。免疫疗法，特别是免疫检查点抑制剂（ICB）疗法在多种肿瘤中均取得了一定的治疗效果。但根据最近的临床研究发现骨肉瘤对ICB反应率不高，这可能与其免疫抑制性TME有关，重塑TME以实现有效的免疫治疗引起了广泛关注。

焦亡是一种由成孔效应蛋白家族（GSDMs）蛋白水解裂解引发的免疫原性细胞死亡。有研究证明能够利用肿瘤细胞中原始表达的GSDMs，通过化学、光热或光动力疗法诱导肿瘤细胞焦亡。然而，GSDMs在许多肿瘤中表达被抑制，导致诱导肿瘤焦亡的效果有限。此外，骨肉瘤中GSDMs的表达水平、临床预后及其与免疫浸润的关系尚不清楚。因此，确认GSDMs调控骨肉瘤TME的关键成员及其作用对于骨肉瘤治疗具有重要意义。

基因治疗需要强大的载体来保护功能性核酸不被降解和清除，并将其递送到靶细胞中。具有丰富羟基的乙醇胺修饰聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGEA)为制备基于聚阳离子的有机或有机/无机载体提供了机会，其羟基和氨基可调的特性赋予它较高的基因递送效率和特异性。因此，基于PGEA的基因载体可能在调节骨肉瘤GSDMs水平诱导焦亡以实现TME重塑方面具有巨大潜力。

本研究首先通过生物信息学分析研究发现GSDMs家族成员GSDME与骨肉瘤患者的预后和免疫浸润正相关。并进一步证实了GSDME作为有效骨肉瘤免疫治疗靶点的潜力。然后，提出了成孔基因传递系统（LPAD/GSDME）联合顺铂（CDDP）诱导骨肉瘤的增强焦亡并重塑TME的治疗策略（图1）。LPAD/GSDME基因递送系统能上调骨肉瘤细胞GSDME单边的表达，联合CDDP促进高比例的骨肉瘤细胞焦亡，肿瘤细胞焦亡促进了促炎细胞因子的释放，募集并激活免疫细胞，实现了骨肉瘤TME的由“冷”转“热”。

然后我们进行相关性分析，以探讨预测GSDMs相关基因与骨肉瘤中GSDMs之间的表达关系（图2b）。结果表明这些基因主要参与正向调控半胱氨酸型内切肽酶活性、白细胞介素-1的分泌、肿瘤坏死因子介导的信号通路、白细胞介素-18的产生等生物过程。细胞成分注释显示这些基因作为炎症小体复合物的组成部分发挥作用，并且总是在细胞质部分起作用，而主要分子功能（MF）由参与凋亡过程的半胱氨酸型内切肽酶活性、半胱氨酸型内切肽酶激活剂活性和肽酶激活剂活性组成。富集的KEGG通路主要包括NOD样受体信号通路、胞浆DNA传感通路、坏死性凋亡。

肿瘤组织中大多数正常细胞是浸润的基质细胞和免疫细胞，它们不仅破坏肿瘤分子信号，而且在癌症生物学中起着关键作用。因此，我们使用ESTIMATE分析推断了骨肉瘤中GSDMs表达水平与免疫细胞和基质细胞丰度之间的关系。骨肉瘤中GSDMA、GSDMC、GSDMD和GSDME的表达水平与肿瘤纯度呈负相关，而GSDMA、GSDMD和GSDME的表达水平与骨肉瘤中免疫细胞和基质细胞的丰度呈正相关（图2c）。我们还通过ssGSEA分析研究了GSDMs表达与28种浸润免疫细胞之间的关联。如图2d所示，GSDMD和GSDME与多达27种不同类型的免疫细胞呈正相关，而GSDMA与26种不同类型的免疫细胞呈有益关系。综合以上生物信息学分析结果，Gasdermin家族中的成员GSDME与骨肉瘤患者预后及TME免疫浸润密切相关。

为了进一步证实GSDMs在骨肉瘤治疗中的潜力，我们使用临床样本进行了进一步研究（图3）。临床样本中免疫细胞浸润的多重免疫组织化学染色显示肿瘤浸润淋巴细胞（TIL，CD3阳性）和自然杀伤细胞（NK细胞，NCR1阳性）密度低；MDSC（CD33阳性）和调节性T细胞（Tregs，Foxp3阳性）密度高（图3a），这一典型的结果证实了骨肉瘤TME的免疫抑制性。

在此基础上，结合生物信息学分析结果，我们进一步评估骨肉瘤中GSDMs的表达。qRT-PCR结果显示，所有骨肉瘤细胞系中GSDMA和GSDME的mRNA表达水平均明显低于对照BM-MSC（图3b）。为了进一步验证上述结论，我们随后对20对匹配的骨肉瘤样本和邻近正常组织进行了qRT-PCR。肿瘤组织和细胞系之间的表达差异可能是由于肿瘤组织中存在各种类型的细胞，如免疫细胞、成纤维细胞或血管内皮细胞，因此肿瘤组织的gasdermin表达并不完全来自骨肉瘤细胞（图3c）。有趣的是，与正常组织相比，骨肉瘤样本中的GSDME mRNA表达下调（图3c），这在TMA中得到了进一步证实（图3d-f）：早期骨肉瘤（ⅠA+ⅡA，AJCC分期系统）患者GSDME的表达明显高于晚期骨肉瘤（ⅡB+ⅣB，AJCC分期系统）患者，进一步表明GSDME的高表达与患者良好的预后相关，也证实了GSDME在骨肉瘤治疗中发挥的积极作用，可能是是骨肉瘤干预治疗的潜在靶点。

为了进一步分析CDDP+LPAD/GSDME治疗引起的细胞焦亡介导的ICD和TME变化，我们进行了流式细胞术分析以量化免疫细胞群的变化（图5a和b）。CDDP+LPAD/GSDME组小鼠淋巴结中成mDC数量显著增加，是对照组的2.5倍。进一步量化肿瘤浸润的免疫相关细胞包括Th细胞、CTL、M1/M2巨噬细胞和MDSC来评估mDC介导的抗肿瘤免疫过程（图5a和b）。在CDDP+LPAD/GSDME组中，骨肉瘤中的CD3+CD4+ T细胞（Ths）和CD3+CD8+ T细胞（CTL）的数量明显升高，分别是对照组的3.4倍和2.7倍；与肿瘤免疫激活相关的M1样巨噬细胞在CDDP+LPAD/GSDME组中明显增加；肿瘤中与免疫抑制相关的典型免疫细胞，包括M2型巨噬细胞和MDSC，在CDDP+LPAD/GSDME治疗中显著下调。因此，可以得出结论，LPAD/GSDME基因递送和化疗协同策略可以将TME重塑为“热”，招募更多的抗肿瘤免疫细胞，增加免疫激活的M1巨噬细胞，减少免疫抑制性免疫细胞。

炎性细胞因子是TME的重要组成部分，本研究通过ELISA检测了骨肉瘤TME中炎性细胞因子分泌的变化（图5c）。与CD8+T细胞募集相关的趋化因子CXCL10在CDDP+LPAD/GSDME组表达增加；白细胞介素因子也能帮助产生免疫激活的“热”TME，IL-2和IL-12可以促进T细胞和NK细胞产生IFN-γ和TNF-α，从而增加NK细胞和T细胞的抗肿瘤活性。ELISA结果显示CDDP+LPAD/GSDME治疗能明显刺激骨肉瘤TME中这两种细胞因子的分泌，而与TME活化和抗肿瘤效率直接相关的IFN-γ和TNF-α在CDDP+LPAD/GSDME组中表达最高，与免疫反应抑制相关的IL-4和IL-10细胞因子分泌受到明显抑制。以上结果进一步证实了CDDP+LPAD/GSDME治疗引起的TME变化有利于肿瘤的抑制。

Rechallenge实验用于研究CDDP+LPAD/GSDME治疗是否能后实现全身抗肿瘤免疫反应并抑制远处肿瘤的生长（图5d-g）。如图5e所示，CDDP+LPAD/GSDME组未检测到远端肿瘤生长，而对照组远处肿瘤发生率为5/7。Rechallenge实验结果进一步证明成孔GSDME基因递送与CDDP给药可以引起全身抗肿瘤免疫反应，并实现远端肿瘤抑制。

聂井君（第一作者）：首都医科大学附属北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所陈大福教授团队特聘副研究员。主要从事生物活性材料、活性分子递送载体的构建及其靶向重塑病理微环境的机制和应用研究。主持国家自然科学基金面上/青年基金、北京市自然科学基金面上项目等8项科研项目，在Adv. Mater.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Bioact. Mater.等发表学术论文 30 余篇，申请专利 6 项。

张博文（第一作者）：北京市创伤骨科研究所、北京大学第四临床医学院北京积水潭医院放射科2023级博士研究生。

罗鹏（第一作者）：首都医科大学附属北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所2021级硕士研究生。

陈大福（通讯作者）：首都医科大学附属北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所骨组织工程与生物材料研究室主任，研究员，教授，博士生导师。从事骨/皮肤缺损再生材料、骨肿瘤切除后再生修复、骨/皮肤与生物材料的相互作用机制研究二十余年，承担或作为骨干参与国自然面上/重点、北自然面上/重点、科技部十四五、十三五专项等国家及北京市科研项目24项，在包括Advanced Functional Materials、Bioactive Materials、ACS Nano等学术期刊发表论文200余篇，总被引8500余次，H指数52。授权专利10件。入选“斯坦福2023年全球生物医学工程领域2%顶尖科学家”。现为国家药品监督管理局（NMPA）创新医疗器械评审委员会委员、NMPA骨科用医疗器械专家咨询委员会委员，中国生物材料学会医用金属材料分会第三届委员会常务委员、中国生物材料学会生物材料表界面工程分会第二届常务委员、中国老年学和老年医学学会骨质疏松分会创伤与转化专家委员会副主任委员，生物材料国际权威杂志Bioactive Materials编委。

刘亚军（通讯作者）：教授，博士生导师，首都医科大学附属北京积水潭医院副院长、北京市创伤骨科研究所PI。英国爱丁堡皇家外科学院院士（FRCS），国家级百千万人才获得者，青年北京学者，有突出贡献中青年专家，享受国家特殊津贴。多年来致力于骨与软组织损伤修复的诊断与临床治疗研究，参编全国高等学校医学研究生规划教材（2014 版），参与制定国际计算机辅助骨科学会指南1项，参与撰写《新型冠状病毒疫情防控期间肌肉骨骼疾病体外冲击波管理专家共识》（2020），参与制定《中国骨肌疾病体外冲击波疗法指南》（2019），《计算机导航辅助外科手术指南》（2016）。先后获资助包括国家自然科学基金重大研究计划在内的项国家/省部级科研项目10余项，发表论文200余篇，他引：1597次；获授权国际发明专利4项，国家发明专利9项和实用新型专利30项，其中4项国家发明专利和5项实用新型专利已经完成临床转化，总金额3081万元。先后获国家科技进步二等奖1项（2015，排名第7/10），北京市科技进步一等奖3项（2018年，排名第6/15；2014年，排名第7/15；2008年，排名第6/6），北京市自然科学二等奖1项（2021，排名1/10），北京医学科技奖二等奖1项（2021，排名1/9），中华医学科技奖二等奖1项（2010年，排名第2/14）。现为中国医学装备协会骨与软组织修复分会主任委员，中国生物医学工程学会医用机器人工程与临床应用分会秘书长，北京生物医学工程学会秘书长，中国研究型医院学会冲击波医学专业委员会副主任委员。

程晓光（通讯作者）：北京积水潭医院放射科主任，北京市创伤骨科研究所PI，博士生导师。2009年获北京市卫生系统高层次卫生人才学科带头人；2018年获北京市高层次创新创业人才支持计划领军人才。长期从事骨放射学临床工作和科研实践，主持国自然面上项目2项、北自然前沿项目1项，累计主编（翻译）书籍16部、发表SCI论文141篇（第一作者23篇，通讯作者40篇）、中文核心期刊文章313篇。现为中华医学会骨质疏松与骨矿盐疾病分会副主任委员、中国医师协会放射医师分会常委兼骨组组长、中华医学会放射学分会骨组副组长，北京医学会放射分会副主任委员，亚洲骨放射学会（AMS）前主席（2017~2019）。