原位形成水凝胶是角膜再生的一种新选择，从其中递送生长因子有可能改善再上皮化和基质重塑。这里开发了一种原位形成的生物正交交联水凝胶，通过光可切割键拴留的表皮生长因子(EGF)，并通过光裂解间隔臂与水凝胶骨架结合，在暴露于紫外线时释放以加速角膜再生。当其应用于角膜缺损时能迅速凝胶化，有出色的透明度和生物相容性。
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1. 引言
外伤引起的角膜缺损可导致并发症，如基质变薄、角膜穿孔和瘢痕形成，最终导致严重的视力损害。虽然角膜移植是治疗视觉上显著瘢痕形成的最有效治疗选择，但其成功取决于移植物组织的可用性、手术专业知识和专用设备。一种备受关注的有前途的替代方案是使用原位形成的水凝胶进行角膜再生，其中聚合物基质直接在角膜伤口上形成。以前，我们已经证明了使用生物正交点击化学反应原位交联水凝胶以促进角膜缺损再生的好处。菌株促进叠氮化物-炔烃环加成反应(SPAAC)是一种无铜形式的点击化学，已被证明可促进神经和细胞再生的支持基质环境，我们已经报道了其在合成原位形成角膜组织替代品中的应用。SPAAC反应具有高选择性，并且与宿主组织细胞和生物分子没有交叉反应性，因此有效地具有生物正交性和高度生物相容性，因此非常适合在角膜上发生的化学反应，其中非纤维化和透明的伤口愈合是最终目标。
结合水凝胶的使用，输送生长Factors已成为增强再上皮化、透明度和整体角膜再生的宝贵策略。神经生长因子(Cenegermin 或 Oxervate)最近被 FDA 批准用于治疗神经营养性角膜病变。同时，其他生长因子，如表皮生长因子(EGF)和肝细胞生长因子(HGF)已被广泛研究，用于损伤后角膜组织再生。水凝胶网络解决了局部使用生长因子的固有挑战，例如需要重复给药和从眼表快速冲洗，可以作为这些分子的有效载体，并提高它们的治疗潜力。通常采用两种主要的制造方法，物理混合物和共轭。虽然将生长因子物理包埋在水凝胶中提供了一种简单方便的方法，但这通常会导致释放速率快，限制了其长期应用的适用性。另一方面，生长因子与水凝胶网络的偶联是一种很有前途的替代方案，但由于它依赖于基质降解，因此存在相对缓慢释放的相反挑战。鉴于正常的角膜再上皮化通常在几天内进行，一种先进的受控生长因子释放策略对于改善对剂量的实时控制以及进而提高角膜再生的效率变得至关重要。
最近，光响应式水凝胶已成为一种前景广阔的解决角膜疾病领域的途径。这些水凝胶利用紫外线(UV)或可见光在聚合物之间诱导交联，从而增强机械性能、粘合性和透明度。此外，利用光来控制纳米颗粒和膜中货物的释放。光响应水凝胶的主要优势在于对释放进行时空控制的潜力：能够在所需的位置和时间精确调节特性。重要的是，我们研究中使用的紫外光照射(365nm)条件的强度低于自然阳光的典型强度(<7 mW/cm²)。值得注意的是，角膜交联(CXL）是 FDA 批准的治疗圆锥角膜的程序，它利用类似的紫外线照射条件与5-磷酸核黄素结合来交联角膜胶原蛋白。
在这里，我们开发了一种光活化的生物正交交联水凝胶，称为PC-HACol水凝胶，设计用于角膜缺损中EGF的原位凝胶化和受控释放(图1a)。该水凝胶通过胶原蛋白-叠氮化物()偶联物和透明质酸聚乙二醇-二苯并环辛炔(HA-PEG-DBCO)偶联物之间的无铜点击化学反应菌株促进的叠氮化物-炔烃环加成反应(SPAAC)进行生物正交交联。EGF首先通过源自邻硝基苯的光裂解(PC)接头接枝到 HA-PEG-DBCO 骨架上。这种PC接头对温和的紫外线照射条件(2–5 mW/cm²)敏感，有助于EGF的有效释放。每种组分(即 HA-PEG-DBCO 和 ColN₃)在混合前(给药前)以溶液形式存在，在给药到角膜缺损后几分钟内成为固体透明的水凝胶，然后进行原位凝胶化。我们评估了PCHACol水凝胶的物理化学性质和生物降解性，并使用原代人角膜上皮细胞评估了在原位形成的PC-HACol水凝胶存在下的细胞增殖和迁移。研究了多次紫外线暴露对离体兔眼再上皮化的影响。然后，我们通过大鼠板层角膜切除术模型研究了体内基质再生和再上皮化。我们分析的目的是为我们的新型PC-HACol水凝胶在角膜伤口愈合中的潜在应用的有效性和安全性提供概念证明。
图1. PC-HACol水凝胶的表征。(a)PC-HACol水凝胶处理的示意图。i)PC-HACol水凝胶的凝胶化和光活化释放。ii)水凝胶预溶液在角膜缺损中的应用。iii)PC-HACol水凝胶的伤口愈合过程。(b,c)PC-HACol水凝胶的存储模量(G′)和损失模量(G")变化b)HA-PEG-DBCO浓度和c)Col-N₃浓度。b)中的Col-N₃浓度固定为9mg/mL，c)中的HA-PEGDBCO浓度固定为70mg/mL。浓度以mg/mL表示。(d)混合后PC-HACol水凝胶在37°C下Tanδ和G′值随时间的变化。(e,f)具有不同e）HA-PEG-DBCO浓度和f）Col-N₃浓度的PC-HACol水凝胶的透射率。(g)PC-HACol水凝胶在背景塑料上带有字母的数字图像。(h)凝胶化30分钟前后冻干的PC-HACol的SEM图像。比例尺：100μm。(i)PC-HACo的酶促生物降解曲线。
2.结果与讨论
2.1.PC-HACol水凝胶的合成和制备
为了从PC-HACol水凝胶中光活化释放EGF，EGF通过伯胺(-NH₂)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应与光裂解(PC)接头偶联。接头的一端是NHS酯，使其能够与人重组EGF上的赖氨酸(K)残基反应。为了形成HA-叠氮化物，透明质酸胺(HA-NH₂;取代度(DoS)：50%)与DBCOPEG-NHS酯(10k)反应形成HA-PEG-DBCO。我们使用PEG作为增溶剂连接子来抵消DBCO偶联诱导的疏水性增加。作为HA-PEG-DBCO的对应物，通过伯胺/NHS反应合成叠氮化物官能化胶原蛋白(Col-N₃)。HA-PEG-DBCO和Col-N₃的DoS值计算分别为3.36±0.25%(n=3)和58.5±13.7%(n=3)。通过SPAAC(即DBCO/N₃反应)将PC接头缀合的EGF偶联到HA-PEG-DBCO，然后与Col-N₃混合。HA-PEGDBCO通过SPAAC反应与Col-N₃反应，混合物在37°C下在5分钟内发生凝胶化(图S1)。
2.2.PC-HACol水凝胶的制备和表征
用于角膜伤口愈合的水凝胶需要坚固的机械强度来维持其结构，直到新的基质再生。具体来说，根据我们之前的研究，用于眼部给药的生物正交交联水凝胶应具有超过1000Pa的储能模量，以便在伤口愈合过程中保持其结构完整性，其模量取决于叠氮化物和DBCO官能化聚合物的浓度。因此，我们制备了四种不同浓度的HA-PEG-DBCO(10、30、50和70mg/mL)和Col-N₃(1、3、6和9mg/mL)(图1b和c)。在所有条件下，EGF通过PC接头与HA-PEG-DBCO偶联，HA-PEG-DBCO和Col-N₃以等体积(1：1，v/v)混合。水凝胶的储能模量随着HA-PEG-DBCO和Col-N₃浓度的增加而增加。值得注意的是，当HA-PEG-DBCO和Col-N₃的浓度分别为70mg/mL和9mg/mL时，水凝胶的储能模量远高于1000Pa(~3100Pa)。因此，最终水凝胶(PC-HACol水凝胶)成分被确定为70mg/mL的HA-PEG-DBCO(与EGF偶联)和9mg/mL的Col-N₃。通过测量储能模量和Tanδ值随时间的变化来研究PC-HACol的凝胶化(图1d)。混合后混合物的储能模量值持续增加，而Tanδ值随时间推移而降低。因此，组分溶液的混合物以时间依赖性方式凝胶化，凝胶化归因于DBCO和叠氮化物基团之间形成的三唑键(SPAAC反应)。
用于眼部应用的水凝胶的一个理想特性是透明度，以促进清晰的视觉。为了研究由HA-PEG-DBCO和Col-N₃组成的水凝胶的透明度，我们测量了它们在400nm至800nm范围内的可见光透射率(图1e和f)。所有水凝胶都表现出高透射率，在整个范围内超过90%。因此，水凝胶在凝胶化后保持其透明度。我们通过将PC-HACol水凝胶放在塑料卡上的刻字上，进一步检查了它的透明度(图1g)。背景字母通过材料清晰易读，证实了PCHACol水凝胶出色的透明度。
除了它的外观之外，我们还询问了使用扫描电子显微镜(SEM)的冻干PC-HACol水凝胶(图1h)。在两个不同的时间对水凝胶冻干：混合后立即(即凝胶前)和混合后30分钟(即凝胶后)。在“凝胶化前”图像中，我们观察到一个相互连接的结构，整个材料中有许多相对较大的孔隙。同时，由于化学反应导致交联密度增加，凝胶化后基质的孔隙率(大小和数量)降低。
用于角膜缺损的水凝胶应为新发可降解再上皮化后的基质再生。正如预期的那样，PCHACol水凝胶表现出胶原酶和透明质酸酶依赖性降解模式，表明它们在角膜缺损内的生物降解性。在含有5CDU/mL透明质酸酶、≥2CDU/mL胶原酶或5单位/mL透明质酸酶和≥2CDU/mL胶原酶的组合溶液中评估PC-HACol水凝胶的分析降解(图1i）。PC-HACol水凝胶在胶原酶溶液和透明质酸酶溶液中均被降解，在胶原酶和透明质酸酶混合物中的降解速率较高。有趣的是，水凝胶也可以单独在胶原酶中完全溶解，这表明胶原蛋白对PC-HACol结构的机械完整性的贡献相对较大。
2.3.体外生长因子释放UV下PC-HACol水凝胶中EGF的释放动力学
在体外研究照射(图2)。在这项研究中，我们制备了三种水凝胶：PC-HACol水凝胶、Non-PC-HACol水凝胶和物理水凝胶。在“非PC-HACol水凝胶”中，使用不可光刻裂解的连接物(叠氮基-PEG5-NHS酯)将EGF与HA-PEG-DBCO偶联(图2a)。“物理水凝胶”由天然Col、HA-NH₂和EGF的物理混合物组成。采用Non-PCHACol和Physical水凝胶作为对照组来比较释放模式。当暴露于温和的紫外线照射下时(图2b和S2)，通过一系列电子转移步骤，接头被裂解，从而允许游离的EGF从水凝胶网络中释放出来。因此，EGF的释放速率取决于紫外线照射和水凝胶网络的结构完整性。
图2c说明了EGF从水凝胶中的释放模式。在物理水凝胶中，EGF迅速释放，在24小时内超过累积释放的85%。相比之下，在紫外线照射下，Non-PC-HACol水凝胶在24小时内仅表现出5.70±0.57%的释放量，在96小时内仅表现出7.99±1.15%的释放量，表明对紫外线照射缺乏响应。值得注意的是，PC-HACol水凝胶表现出EGF的控释模式，这取决于紫外线照射。PC-HACol水凝胶在无照射下表现出最小的释放(0-12小时为6.2±1.8%;24-36小时为2.8±1.3%;48-60小时为0.6±0.8%;72-84小时为0.6±0.8%)。然而，它在紫外线照射下释放的EGF量明显更大(12-24小时为18.2±3.3%;36-48小时为15.3±6.7%;60-72小时为5.9±4.9%;84-96小时为8.2±1.5%)(表S1)。由于释放量取决于水凝胶中的剩余量，因此我们计算了两种不同照射条件下的标准化EGF释放量(图S3)。有趣的是，与弱紫外线照射(2mW/cm²10分钟)相比，强紫外线照射(5mW/cm²持续10分钟)下EGF的释放量更大。因此，PC-HACol水凝胶可能表现出强度依赖性的EGF释放模式。
根据辐照进一步研究释放模式条件下，我们通过四种不同的照射时间(0、1、5和10分钟)以2mW/cm²(图2d)和强度(0、1、2和5mW/cm²)制备水凝胶，持续10分钟(图2e)。在没有照射的情况下，PC-HACol水凝胶在12小时内释放了5.3±0.2%的EGF，这可能是由于合成过程中未共轭的馏分。值得注意的是，PC-HACol水凝胶表现出时间依赖性的EGF释放(1分钟时10.4±1.2%;5分钟时12.4±1.0%;10分钟时16.9±1.2%)和强度依赖性EGF释放(1mW/cm²时14.1±0.3;2mW/cm²时16.9±1.2%;5mW/cm²时22.9±0.8%)。这些结果表明，可以通过调整照射时间和强度来控制EGF的释放。
图2.HACol水凝胶的体外EGF释放。(a)PC-HACol和非PC-HACol水凝胶的结构。在这种结构中，“HA”和“EGF”分别表示透明质酸和表皮生长因子。(b)在轻度紫外线照射下EGF的光裂解释放方案。(c)1%BSA溶液中水凝胶的体外EGF释放曲线(n≥3)。通过物理混合天然Col、HA和EGF制备物理水凝胶。PC-HACol和非PC-HACol水凝胶在两种不同的条件下用紫外光照射4次。水凝胶在12和60h用低强度紫外光(2mW/cm²，10min)和36和84h用强紫外光(5mW/cm²，10min)照射。(d，e)EGF的释放量随变化d)2mW/cm²的照射时间(n≥3)或e)紫外线强度10分钟(n≥3)。照射后12小时测量EGF的量。d)中0min时EGF的释放量等于e)中0mW/cm²时的释放量。N.S.：不重要。
2.4. 体外细胞增殖和迁移
EGF可以促进上皮细胞的增殖和迁移损伤部位。为了研究细胞增殖，将原代角膜上皮细胞(CEC)孵育一天，然后用PC-HACol水凝胶处理(图3a)。我们评估了我们选择的紫外光条件对CEC的相对细胞毒性(图S4)。将水凝胶加入细胞后，用紫外光(2mW/cm²，持续5分钟)照射。为评价紫外光的效果，1组通过添加PC-HACol水凝胶制备，无需照射。通过将值与未处理的细胞进行比较来计算细胞活力(%)。值得注意的是，在所有浓度下，测得的细胞活力均高于100%，表明至少，所测试的紫外线照射条件对细胞无毒。有趣的是，在没有紫外光的情况下，PC-HACol水凝胶在5和10mg/mL时没有增加细胞活力，并且在50mg/mL时细胞活力显著低于紫外光。这些结果表明，当与聚合物链结合时，EGF的活性显着降低。
除了细胞活力外，我们还研究了细胞迁移的速率当用PC-HACol水凝胶处理时(图3b)。将CECs培养至汇合度超过90%，然后在中间形成线性划痕以模拟角膜上皮伤口。对照组(无处理组)在48h内划痕面积减少到29.9±12.2%。令人惊讶的是，与无治疗组相比，无紫外线的PC-HACol组(PC-HACol组)没有表现出显着差异(48小时内26.4±9.3%)。相比之下，在紫外光照射下，PC-HACol水凝胶组(PC-HACol+UV)在48小时内表现出完全闭合。因此，PC-HACol水凝胶需要用紫外光照射以促进细胞迁移。这些结果表明，EGF需要从聚合物链中释放出来才能有效发挥作用。
2.5. 细胞相容性
PC-HACol水凝胶的细胞相容性由观察细胞在水凝胶上的生长(图3c和d)。将PC-HACol水凝胶薄薄地铺在细胞培养皿的底部，并在水凝胶包被的培养皿上培养CECs。在水凝胶未涂层培养皿(无处理组)中，细胞群达到179±28个细胞/cm²，死细胞群占1.4±0.7%。同样，细胞在水凝胶上生长，细胞群为185±45个细胞/cm²，死细胞为2.2±0.8%。因此，PCHACol水凝胶不会阻止细胞生长。有趣的是，在紫外线照射下，PC-HACol水凝胶促进了细胞生长，细胞群显著增加至252±57个细胞/cm²，而死细胞比例降低(0.5±0.4%)。
2.6. 3D细胞培养模型中的细胞迁移测定
在3D细胞培养模型中评估了角膜基质细胞向PC-HACol水凝胶基质中的迁移(图S5)。在这项研究中，我们建立了一个杂交细胞培养系统。我们使用了杂交水凝胶基质，其中一半含有封装在胶原蛋白基质(3-5%,v/v)中的角膜基质干细胞(CSSC)，而另一半由不含细胞的PC-HACol水凝胶组成。在杂交基质的顶部添加细胞培养基，为细胞提供营养。孵育7天后，杂交基质似乎分为两个不同的部分(图3e)，表面粗糙(A部分)和光滑表面(B部分)，分别对应于胶原蛋白基质和PC-HACol基质。为了观察基质中的细胞，我们将杂交基质与Calcein-AM一起孵育，并使用具有z堆栈模式的共聚焦显微镜以四个不同的角度观察活细胞(图3f)。在胶原蛋白基质(A部分)中观察到致密和普通的细胞层，其来源于最初封装的CSSC。值得注意的是，在PC-HACol水凝胶基质(B部分)中也观察到细胞，其中细胞最初没有被封装。因此，在第B部分观察到的细胞来源于胶原基质中的细胞，表明细胞从胶原基质迁移到PC-HACol基质。这一结果表明，我们的PC-HACol水凝胶基质可以作为基质再生的床。
图3.使用CEC和CSSC进行体外细胞增殖和细胞相容性。(a)在或没有紫外线照射下与PC-HACol水凝胶共培养时的细胞增殖(2mW/cm²，持续5分钟)(n=4)。CCK-8法测定细胞活力。(b)划痕测定48小时(n=4)。CECs用PC-HACol水凝胶处理，一组接受紫外线照射(5mW/cm²持续10min)，另一组未接受照射。条形图表示相对于0h处的面积，以平方微米为单位的标准化损伤区域。比例尺：400μm。(c)PC-HACol水凝胶对CECs的细胞相容性。将CECs接种并在PC-HACol水凝胶包被的细胞培养皿上培养48小时。孵育后，用钙黄绿素-AM(绿色)对活细胞进行染色，用乙锭同型二聚体-1(红色)对死细胞进行染色。比例尺：100μm。(d)描绘c)(n=6)中活细胞和死细胞群的条形图。(e)3Dcel的表面明场图像。
2.7. 兔眼的离体再上皮化
角膜损伤后的再上皮化是伤口正常愈合的初始和关键过程，是眼睛免受感染和其他有害暴露的初始保护措施。生长因子可以促进这一过程。根据体外细胞研究的结果，我们假设从网络中光裂解后释放EGF比共价结合的EGF更有效，并且在几天内的多次紫外线照射会维持EGF的释放，促进愈合过程。为了初步证明PC-HACol水凝胶的伤口愈合效果，我们使用了使用兔眼的离体3.5mm前板层角膜移植术(ALK)模型。在这项研究中，将PC-HACol水凝胶应用于手术制备的角膜基质伤口，并用紫外线(2mW/cm²,5分钟)照射1次或3次(图4)。对照组未进行光照射。通过用荧光素对缺损进行染色来评估缺损中的再上皮化(图4a)。当水凝胶未照射时，荧光素染色在伤口上持续存在5天，而接受一次性紫外线照射的眼睛(在第0天，水凝胶给药后)往往在2-4天内出现伤口闭合(图4b)。有趣的是，与仅一次照射相比，具有3次紫外线照射暴露(第0天、第1天和第2天)的PC-HACol水凝胶表现出明显更快的再上皮化。这些结果表明，随着时间的推移，离散剂量的EGF光激活释放增加了PC-HACol水凝胶的伤口愈合效果。
图4.兔眼的离体再上皮化(n=3)。(a)角膜缺损的代表性裂隙灯(缺陷区域)和荧光素染色图像(第0天-第6天)。将PC-HACol水凝胶涂在伤口上，用紫外光(2mW/cm²，持续5分钟)照射。使用相同的照射条件，在第0天施用一次紫外光，或在第0、1和2天施用3次紫外光。以无紫外线照射的PC-HACol水凝胶为对照组。(b)测量每组的荧光素染色面积。*与其他组相比，p<0.05。
2.8. 大鼠体内伤口愈合效果
在大鼠中评估PC-HACol水凝胶的角膜再生超过7天。在ALK期间使用2.0mm环钻建立角膜缺损模型。在这项研究中，为了尽量减少紫外线照射的麻醉暴露并遵守相关的动物伦理学，我们照射了一次紫外线，但与离体研究相比，照射时间更长(10分钟)。此外，我们选择了大鼠模型而不是兔子模型，因为它的角膜修复过程更快，仅一轮照射就可能导致显着差异。紫外线照射对角膜造成的损伤在大鼠中得到验证(图S6)。将PC-HACol水凝胶应用于角膜缺损，紫外线照射(2mW/cm²，10分钟)或不照射。PBS处理组作为对照组。在图5a中，角膜的光学相干断层扫描(OCT)图像显示，在第0天，产生了40–60%深度的角膜缺损，并且在缺损中观察到应用的水凝胶(用橙色箭头标记)。术后1天，PBS处理的眼睛没有明显的基质再生，而PC-HACol水凝胶组表现出更大的角膜再生。在紫外线照射下，PC-HACol水凝胶组比其他组表现出更快、更广泛的再生。与PBS组相比，PC-HACol水凝胶组(即PC-HACol和PC-HACol+UV)的角膜再生差异在以下检查中更加明显。除了OCT图像外，我们还使用裂隙灯图像监测了受伤眼睛的外观(图5b和S7)。所有PBS处理的大鼠均表现出临床上明显的中央角膜混浊。同时，PC-HACol组在前3天也显示出一定程度的纤维化愈合，但这种疤痕在第5天和第7天显着减少。随着紫外线照射导致EGF的光裂解和释放，PC-HACol处理的角膜表现出透明度显着提高。
通过对用荧光素处理的缺陷(图5c和d)。在PBS组中，角膜缺损持续的时间比PC-HACol水凝胶中的角膜缺损持续时间更长，PCHACol水凝胶组荧光素染色面积显著较小。这些结果与我们之前关于生物工程水凝胶改善角膜再生的报道一致。因此，即使没有紫外线照射，PC-HACol水凝胶的应用也能促进伤口愈合过程。值得注意的是，在紫外线照射下，PC-HACol水凝胶显着加速了再上皮化，在一天内实现了一半大鼠的完全再上皮化。另一半的荧光素染色面积小于5%。这些结果表明，PC-HACol水凝胶释放的EGF促进上皮细胞的增殖和迁移，导致更快的再上皮化。
为了进一步分析材料对角膜再生的影响，我们测量角膜和上皮的厚度(图5e和S8)。在第0天手术时，所有组大约50%的角膜通过前角膜切除术被切除(图5e)。在PBS组中，角膜厚度连续增加5天(第1天为52.5±3.4%;第3天为48.2±8.8%;第5天为58.7±10.2%)，并从第5-7天显着增加(第7天为76.3±4.5%)。相比之下，PC-HACol组从第1天开始表现出明显较厚的角膜层(72.7±8.6%)，而PC-HACol+UV组的相同层明显较厚(91.3±12.9%)。PC-HACol+UV组在评估期间显示出最高的角膜厚度(最接近天然角膜)，到第7天再生到101.6±3.1%的厚度。因此，暴露于紫外光下的PC-HACol水凝胶在表面上皮化和基质再生方面都表现出显着更大的促再生作用。除了角膜，我们还研究了上皮层的厚度，因为上皮增生是角膜愈合过程中常见的异常，尤其是在伤口较深的情况下(图S8)。正如预期的那样，与正常角膜(34.0±1.6μm)相比，PBS处理的角膜上皮厚度增加了1.53倍(52.0±7.1μm)。令人惊讶的是，在PC-HACol组(33.3±4.0μm)和PC-HACol+UV(33.0±1.4μm)组中未观察到这种现象。因此，这些结果表明PC-HACol水凝胶促进损伤后角膜上皮厚度恢复到基线水平。
使用裂隙灯图像(图5f)量化角膜混浊，作为相对于再生角膜表面积的%面积疤痕的函数。在评估期间，所有PBS处理的眼睛在缺损上都表现出明显的疤痕(第0天31.0±17.4%;第3天36.9±14.0%;第5天60.3±8.8%;第7天48.9±9.8%)，表明严重视力障碍。令人惊讶的是，PC-HACol水凝胶组表现出临床可观察到的疤痕长达3天(第1天为39.3±24.7%;第3天为29.2±19.6%)，疤痕从3天到7天明显减少，到第7天时光学清晰度大大提高(第5天为28.9±13.2%;第7天为18.8±9.0%))。重要的是，在评估期间，紫外线暴露的PC-HACol组很少观察到疤痕(第1天为9.0±10.5%;第3天为12.3±9.4%;第5天为1.4±2.7%;第7天为2.6±3.0%)，疤痕面积明显小于其他组。因此，PC-HACol水凝胶减轻了愈合过程中的疤痕形成，紫外线照射诱导的网络内EGF光裂解进一步加强了水凝胶的抗疤痕作用。
图5.大鼠体内角膜伤口愈合(n=4)。(a)PC-HACol水凝胶处理的角膜7天的OCT图像。这些图像是在第0、1、3、5和7天拍摄的。橙色箭头表示在缺陷上施加的PC-HACol水凝胶。(b)缺陷眼睛的裂隙灯图像。(c)缺陷的荧光素染色图像。眼睛中心的绿色表示染色区域。(d)根据c)计算的荧光素染色面积。(e)缺损中角膜的平均厚度。通过将厚度除以正常角膜的厚度来标准化。(f)评估期间眼睛上的疤痕区域。N.S.：不重要。
2.9.治疗角膜缺损的免疫组织化学分析
通过免疫组织化学分析进一步研究第7天的再生角膜，以可视化生物标志物(图6)。图6a-d描述了α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达——纤维化愈合的标志物——在再生的基质层中。在角膜再生过程中，活化的角质细胞可以分化成表达α-SMA的肌成纤维细胞，可能导致轻度至重度瘢痕形成。重要的是，与PBS(图6a)相比，PC-HACol水凝胶的α-SMA表达(图6b)明显较低，而紫外线照射下的表达要低得多(图6c和d)。这些结果表明再生角膜中的肌成纤维细胞活性和纤维化减少，这与裂隙灯图像中观察到的清晰透明度一致(图5b)。为了进一步研究角膜透明度，我们评估了醛脱氢酶3A1(ALDH3A1)的表达，这是一种角膜晶状体蛋白和角膜健康和透明度的生物标志物(图6e–h)。用PC-HACol水凝胶+紫外光照射组处理的角膜上皮在所有层中均ALDH3A1表达(图6g)，而PBS处理组和PC-HACol组在上皮层表现出不均匀和低表达模式(图6e和f)。PC-HACol+UV组的ALDH3A1信号强度也显著高于其他组(图6h)。结合上述α-SMA表达模式，这些结果可以解释各组之间角膜透明度的差异。
此外，我们检查了再生上皮细胞角蛋白12(CK12)的表达模式，再生上皮细胞角蛋白和细胞分化标志物是角膜特异性细胞角蛋白和细胞分化标志物(图6i–l)。PBS组在上皮层的浅表细胞上显示出高度极化的表达模式(图6i)。PC-HACol组也表现出与PBS组相似的CK12的异质表达模式，但在基底层也观察到这种表达(图6j)。相比之下，PC-HACol+UV组在所有上皮层中都表现出CK12的阳性和均匀表达，这表明与其他组相比，紫外光下的PC-HACol水凝胶导致再生层的上皮分化更高且正常(图6k和l)。除了上皮标志物外，通过对F-肌动蛋白进行染色可观察到再生的基质层(图S9)。在靠近上皮层的基质中高度观察到F-肌动蛋白，表明再生位点的细胞-基质存在机械相互作用。
图6.第7天收获的角膜的免疫组织化学分析。(a–c)a)PBS组、b)PC-HACol组和c)PC-HACol+UV组的α-SMA表达模式。(d)α-SMA强度的定量，由PBS组的平均值(n=4)归一化。(例如)ALDH3A1e)PBS组f)PC-HACol组，g)PC-HACol+UV组的表达。(h)用PBS组的平均值(n=4)归一化的ALDH3A1强度的定量。(i–k) i)PBS组、j)PC-HACol组和k)PC-HACol+UV组的CK12表达。(l)由PBS组的平均值(n=4)归一化的CK12强度的定量。比例尺的长度为20μm。
3.结论
我们开发了一种新型的、原位形成的生物正交交联水凝胶，能够随后光激活释放EGF用于角膜再生。通过HA-PEGDBCO和Col-N₃之间的SPAAC点击化学反应合成生物正交交联水凝胶，在角膜缺损内在几分钟内实现快速凝胶化。使用光裂解接头将EGF与HA-PEG-DBCO偶联，使水凝胶在温和的紫外线条件下释放EGF。释放的EGF量取决于紫外线强度和照射时间。在紫外线照射下，PC-HACol水凝胶促进了角膜上皮细胞的增殖和迁移，具有优异的生物相容性。角膜缺损的再上皮化速率也受紫外线照射频率的影响，如离体兔角膜器官培养研究所示。在体内大鼠中，与无紫外线照射和无任何凝胶处理的治疗条件相比，暴露于紫外线后的PC-HACol水凝胶显着促进了无增生的再上皮化以及基质再生，恢复到基线角膜厚度。我们的结果表明，具有可控生长因子释放的原位形成、生物正交交联水凝胶可能是治疗角膜缺损的一种有前途的先进方法。
02
通讯作者：David Myung
Dr. Myung is an Associate Professor of Ophthalmology at the Byers Eye Institute at Stanford and, by courtesy, of Chemical Engineering. He is a board-certified ophthalmologist and attending physician specializing in cataract and corneal surgery and external diseases of the eye, and the Director of the Ophthalmic Innovation Program, a project-based fellowship in the development and regulatory science of new eye care technologies. Dr. Myung leads an NIH-funded translational research laboratory focused on two areas of clinical need: (1)ophthalmic regenerative medicine through tissue engineering and drug delivery, and (2) global health through mobile technologies and telemedicine. His research group takes an interdisciplinary approach toward fostering regeneration of ocular tissues, by using chemistry to not only build biomimetic cellular architectures but also to target and release bioactive molecules to promote healing. Current projects are directed toward the use of bio-orthogonal and supramolecular crosslinking chemistries for the localized delivery of growth factors and/or stem cells to wound sites, the synthesis of bioactive wound dressings and vehicles, the creation of biopolymeric tissue scaffolds, and 3D bioprintable inks for tissue engineering.
Dr. Myung is also Director of the Stanford Teleophthalmology Autonomous Testing and Universal Screening (STATUS) Program, which is pushing the boundaries of telemedicine and AI to improve eye care worldwide. He and his collaborators investigate the role of mobile technologies and AI in enabling diagnostics and patient care outside of traditional health care settings. Their goal is to challenge current paradigms of eye care delivery through new digital health technologies and telemedicine to increase access to care in resource-limited settings both in the US and abroad. In collaboration with his retina, primary care, and endocrinologist colleagues at Stanford, he has organized and leads a Bay Area-wide Remote Diabetic Eye Care Program. Through this program, patients with diabetes can have their eyes photographed and analyzed by an FDA-cleared autonomous artificial intelligence algorithm at clinics throughout the Bay Area and then, if needed, referred in for further evaluation by a retina specialist.
03
这项工作得到了防盲研究(RPB)以及来自国家眼科研究所(NIHR01EY035697、R01EY033363-03、K99EY034168 和P30EY026877)、哈灵顿发现研究所学者创新者计划以及通过韩国国家研究基金会(NRF)的基础科学研究计划资助由教育部资助(RS-2023-00247051)。斯坦福纳米共享设施和斯坦福工程学院软材料设施也进行了实验。
04
The title of the article is “Photoactivated growth factor release from bio-orthogonally crosslinked hydrogels for the regeneration of corneal defects”
DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.05.045
翻译：李颖，南京理工大学
校稿：沈建良，温州医科大学
Bioactive Materials 创建于2016年，自2019年被SCIE检索收录以来影响因子实现跳跃式增长(IF 2019: 8.724；IF 2020: 14.593；IF 2021: 16.874；IF 2022:18.9; IF 2023: 18)；JCR materials science, biomaterials 领域国际排名连续四年第一。此外， 2020年到2023年连续四年入选中国科学院文献情报中心期刊分区表一区，Top期刊；入选材料科学综合类高质量科技期刊分级目录T1区。
