印度Hrudayanath Thatoi团队最新研究结果
A comparative study on pretreatment of rice straw and saccharification by commercial and isolated cellulase–xylanase cocktails towards enhanced bioethanol production
不同纤维素酶-木聚糖酶混合物预处理稻草对生物乙醇产量的比较研究
原文链接
https://doi.org/10.1007/s43393-023-00228-6
生物乙醇作为一种可再生能源，其生产过程中的效率和成本问题一直是研究的重点。作者在本研究旨在探讨从利用木质纤维素酶提高木质纤维素生物质转化为生物乙醇的效率。作者发现相较于使用酸性、生物预处理稻草，使用碱预处理稻草得到的纤维素（199.33 ± 0.2 mg/g）和半纤维素（62.21 ± 0.22 mg/g）含量最高。同时，使用细菌中纤维素酶-木聚糖酶继续酶解预处理后的稻草，获得的总还原糖的产量仅为使用商业纤维素酶-木聚糖酶混合物处理获得还原糖的60.33%。在商业纤维素酶-木聚糖酶介导的水解过程中，在条件为37.5°C、pH-7、稻草浓度2.5 g/100 mL、酶量添加175 μl、孵育时间42小时得到最大葡萄糖、木糖和总还原糖产量分别为309 ± 0.32 mg/g、190.7 ± 0.42 mg/g 和 499.7 ± 0.37 mg/g，而在使用细菌中提取的天然纤维素酶-木聚糖酶混合物时，葡萄糖、木糖和总还原糖的最高产量分别为253.52 ± 0.56 mg/g、47.94 ± 0.78 mg/g 和 301.46 ± 0.67 mg/g。随后，作者进一步在碱预处理的稻草上使用细菌提取的酶进行酶解后，得到的产物再经由Saccharomyces cerevisiae在35°C、孵育时间58小时、pH 5.5条件下发酵得到生物乙醇，浓度约为32.57 ± 0.25 g/L，是使用商业纤维素酶-木聚糖酶得到的生物乙醇浓度（34.69 ± 0.28 g/L）的93.89%。作者认为从自然界挖掘更高效的酶对于提高生物乙醇产量具有重要价值。
图一 从稻草到生物乙醇的转化流程图
研究背景
在生物乙醇生产中，如何提高底物预处理和糖化过程所用酶的效率是关键问题。利用细菌、真菌和藻类生产的纤维素酶等，可以快速将纤维素转化为葡萄糖，而细菌由于其快速增长和高产量的特性，成为生产纤维素酶的理想选择。由于商用酶的成本较高，作者转而比较从自然界中木质纤维素分解细菌和真菌提取生产成本低但效率高的纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶。作者通过预处理，改变木质纤维素生物质的化学构成，以提高其糖化过程中可发酵糖的产出。有效的预处理方法还需考虑能源需求低和成本低的因素。本研究采用物理、化学、物理化学和生物等多种预处理方法进行比较，发现在稻草上的使用碱处理可以显著提高糖产量和乙醇产出。
在实际应用中，生物质预处理需放大规模以满足大规模能源需求，其中包括优化预处理流程以降低环境影响。预处理完成后，获得的纤维素和半纤维素需通过酶水解进一步分解为葡萄糖和木糖，供发酵微生物转化为乙醇。在生物乙醇的生产中，不同生物质来源和发酵过程中微生物的选择，都会影响最终的乙醇产量。例如，在农业废弃物中，甘蔗渣的葡聚糖消化性最高，而竹子最低。作者比较了不同方式对稻草进行预处理的影响，以增强纤维素和半纤维素的含量，并比较了不同酶对预处理后稻草进一步水解的效果。
科学发现
作者首先研究了对稻草进行酸处理的最佳预处理条件。酸处理对于稻草细胞壁中纤维素和半纤维素与木质素的分离具有显著影响。作者对预处理的四个因素，即温度（70°C、95°C 和 120°C）、稀硫酸浓度（0.5%、1.25% 和 2%）、孵化时间（30、55 和 80 分钟）以及基质（稻草）浓度（30、60 和 90 g/L），在摇瓶中进行了预处理比较。研究结果表明，在酸浓度为0.5%、温度为120°C、孵化时间55分钟和基质浓度60 g/L的条件下，所获得的纤维素含量最高，达到88.33 mg/g（图二，表一）。
图二 多因素优化稻草的生物质转化率
表一 稻草预处理方式比较
同时，在使用生物法预处理稻草的研究中，作者发现，使用1%接种量的木质素降解细菌（巴斯德芽孢杆菌，Bacillus mycoides），于处理时间、温度和稻草量分别维持在10.5天、37.5°C和60 g/L的条件下处理后，从稻草获得中的纤维素、半纤维素和木质素含量分别达到最高值，分别为151.67 mg/g、58.33 mg/g和1.956（根据205 nm处的吸光度计算）。根据ASL和AIL的数据，在这种条件下经生物预处理后稻草总木质素含量为88.36%。通过响应面分析（RSM）表明，当细菌的接种量从0.5%增加到1%，孵化时间从14天减少到10.5天时，纤维素和半纤维素的产量分别从89 mg/g和34.23 mg/g增加到151.67 mg/g和58.33 mg/g
图三 生物预处理稻草的RSM分析
此外，作者在对未处理、酸处理和碱处理后的稻草进行结构分析时，采用了场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）来观察结构变化。结果显示，未处理的生物质（稻草）表面坚固且结构有序，与预处理后的生物质相比较（图四A）。相反，经过酸和碱处理后的生物质表面变得破碎和粗糙（图四B、C）。特别是，经过碱处理的稻草表面残留物显著减少，可以看到明显离散的木质素滴，这意味着稻草表面的木质素已经被去除。更具体地说，经稀碱溶液预处理后的稻草没有明显纤维结构，表面变得膨胀和松散，并出现许多孔洞。在碱处理过程中，木质素和其他非纤维素成分从纤维中分离出来，纤维素纤维的结构也随之扩张。未处理和经碱处理的稻草样品之间的这些结构差异表明，经碱处理的稻草对酶更易接触，这可能导致酶解水解效率的提高。
图四 未处理纤维素的 FE-SEM 显微照片
作者进一步使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）来分析稻草在预处理前后成分的变化，即对未处理、稀酸（0.5% H2SO4）和稀碱（1.25% NaOH）预处理的稻草进行了FTIR光谱分析。未处理、稀酸和碱预处理稻草中不同官能团的振动变化观察结果及其总结分别展示在图四E和表二中。在3456和3412 cm−1附近的峰指示了O-H伸缩振动，这表明稀酸和碱预处理的稻草中纤维素主链上的氢键受到了破坏。而在1526和1516 cm−1的芳香环伸展振动也出现在稀酸和碱预处理的稻草中，作者推测其与木质素的去除有关，因为在未处理的稻草中没有出现该峰。
表二 预处理纤维素中的红外光谱中谱带位置
作者着重关注碱预处理后稻草后续在酶水解过程中的效率。研究表明，即使大部分晶态纤维素和木聚糖被去除，剩余的晶态纤维素和木聚糖仍可能降低纤维素和半纤维素水解成简单糖的效率。纤维素酶和木聚糖酶在有效降解含纤维素和木聚糖的木质纤维素材料中起关键作用。虽然对纤维素水解为葡萄糖的研究较多，但木聚糖酶在半纤维素水解中的作用和机制尚不明确。
作者进一步优化了纤维素酶和木聚糖酶的比例，以实现稻草的最佳糖化效果。在实验中，作者调整了细菌提取纤维素酶和商业木聚糖酶的添加比例，同时控制温度、pH值、基质浓度和处理时间等参数。通过响应面法（RSM），为两种酶设计了22种实验组合。
在商业酶实验中，RSM中最大反应值分别为葡萄糖309±0.32 mg/g、木糖190.7±0.42 mg/g和总还原糖499.7±0.37 mg/g，实验条件为37.5°C、pH 7、基质浓度2.5 g、酶加载量175 µL和孵化时间42小时。响应图（图五）表明酶加载量和基质浓度对糖化至关重要。统计模型的决定系数（R2）值高，表明模型能够充分解释响应的变异性，实验值和预测值之间具有良好的一致性。这些结果表明，该设计空间的可用于优化稻草的酶水解过程。
图五 碱处理后稻草在商业酶水解产生糖类的响应面与残差分析
表三 不同酶糖化碱处理稻草还原糖产量
随后作者探讨了利用从细菌菌株分离出的天然酶对碱处理后的稻草进行酶解水解的实验。通过响应面法（RSM）对22种不同的实验条件进行了实验验证，结果表明，在碱处理稻草的酶解水解过程中，最佳的实验条件是：温度37.5°C，pH值5，底物浓度2.5%，酶负荷2毫升（包括天然纤维素酶和木聚糖酶），处理时间42小时，得到的葡萄糖、木糖和总还原糖产量分别为253.52±0.56 mg/g、47.94±0.78 mg/g和301.46±0.67 mg/g。通过方差分析（ANOVA）确定了五个参数（温度、pH值、底物浓度、酶负荷和孵育时间）及其相互作用对响应（葡萄糖、木糖和总还原糖产量）的影响。
此外，作者还对比了不同前处理和水解条件下稻草糖化率的最大值（表四）。例如，使用微波辅助稀酸水解、酸预处理和酶水解、铵纤维扩张预处理、蒸汽爆破和碱预处理以及有机溶剂预处理等方法，糖化率的最大值分别为27.81%、70.22%、74%、82.60%和46.2%。本研究发现，使用细菌提取的酶进行糖化的最大糖化率为60.33%。
总的来说，作者认为通过优化酶解水解条件，可以有效提高碱处理稻草的糖化率。这一发现对于生物质能源的开发和利用具有重要意义。
表四 综述文献报道最佳预处理后稻草糖化产量
随后，作者利用S. cerevisiae进一步发酵糖分以及生产乙醇的过程。首先，生物乙醇的生产经过酶解前处理和纤维素的酶解水解，酶解水解后产生的可发酵糖可以通过效率高的酵母菌株发酵，以生产乙醇。酿酒酵母是较为合适的发酵菌株，因为它能够从葡萄糖中产生高浓度的乙醇，对发酵终产物有较高的耐受性，且具有较高的生产速率。
在这项研究中，作者采用了酵母介导的糖化-发酵偶联的生产方法，即在35°C、pH 5.5条件下，使用单独的商业纤维素酶或者商业纤维素酶-木聚糖酶混合酶处理后的碱预处理稻草并添加酿酒酵母产生生物乙醇的工艺。作者比较了不同处理周期（30小时、42小时、58小时和72小时）下转化乙醇的产量（图六）。
图六 稻草糖化后生产生物乙醇
总结展望
本研究表明，在处理农业废弃物如稻草时，与酸预处理或生物预处理相比，碱预处理后的稻草能更好的作为酶水解之后的产物。尽管在本次实验中，商业酶（纤维素酶和木聚糖酶）的糖化效率高于细菌提取的纤维素酶和木聚糖酶，但通过进一步工程化改造这些分离酶，可以更有效地生产可发酵糖。如果这种经过改造的酶可同时利用己糖和戊糖，可能进一步提高生物乙醇的生产效率，实现一体化生物处理。此外，使用细菌提取的纤维素酶-木聚糖酶比使用商业酶所得到的乙醇浓度更高，这表明对这些分离酶进行前沿改造可能是提高乙醇生产的重要途径。
综上所述，通过生物预处理技术可以有效分解稻草中的生物质，同时需要进一步改造的特定酶来继续提高可发酵糖产量。这不仅为利用农业废弃生物质转化生物乙醇提供了新思路，也为提高生物乙醇产量和工艺效率提供了科学依据。此外，该研究还展示了通过改造生物酶来提高乙醇产量的潜在价值，为生物燃料领域的创新提供了新的方向。
图七 基于稻草生产生物乙醇流程示意图
引用方式
Paul, M., Shroti, G.K., Mohapatra, S. et al. A comparative study on pretreatment of rice straw and saccharification by commercial and isolated cellulase–xylanase cocktails towards enhanced bioethanol production. Syst Microbiol and Biomanuf (2024). https://doi.org/10.1007/s43393-023-00228-6
Systems Microbiology and Biomanufacturing(系统微生物学与生物制造，简称SMAB，ISSN：2662-7655) 是由江南大学与Springer Nature出版集团合作主办的英文期刊。期刊SMAB致力于为工业微生物与生物制造过程领域的新发现、新方法和新技术提供报道的平台，江南大学副校长徐岩教授担任主编，Bioresource Technology期刊主编Ashok Pandey教授担任期刊首席顾问，更多内容详见期刊主页。
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