酶改造实现纤维素高效糖化——系统微生物学与生物制造文章推荐

Strain improvement for cellulolytic enzymes for effective saccharification of lignocellulosic biomass by mutant of Penicillium funiculosum NCIM 1228

改造绳状青霉菌内源酶实现木质纤维素的高效糖化

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https://doi.org/10.1007/s43393-024-00247-x

      各种农业废弃物产生的木质纤维素生物质（LCB）可以备高效降解并用于低成本生产各种高附加值产品。然而，在工业上规模化使用LCB来生产生物燃料等产品的过程中需要使用大量纤维素酶，因此纤维素酶的微生物生产与活性同木质纤维素的转化成本密切相关。近来，如何低成本、高效率的利用真菌发酵生产纤维素酶等的研究受到人们的关注。Penicillium funiculosum NCIM 1228是一种合适纤维素酶生产菌株，它内源存在有效水解LCB所需的四种酶。作者在本研究的主要目标是利用随机突变增加酶的活性、产量和生产效率。通过乙基亚磺酸乙酯（EMS）突变得到的潜在突变体D4，其FPase、CMCase、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的活性分别比出发菌株高出6.47倍、3.05倍、3.03倍和3.19倍。在40升发酵罐规模下，突变体D4展示出了17.96 g/L的蛋白产量，同时FPase、CMCase和木聚糖酶在十天内生产率分别为479、4249和6987 U/L/天。此外，突变体的粗酶液可以直接对LCB进行糖化，产生了3.54％的葡萄糖，同时达到了54.03％的纤维素转化效率，与商业化配方酶的效率相近（53.07％），表明其对未来应用的有希望的潜力。

图一 筛选高酶活突变体的工作流程

     作者在EMS诱变突变体产生纤维素酶的实验中，设置每组实验初始孢子计数为2.2 × 10⁶/mL，使用不同浓度的EMS进行诱导突变，分别为2、4、6、8、10、15、20、25和30 mg/mL，标记为B1至B9。实验组在不同浓度的EMS下处理60分钟。EMS通过烷基化鸟嘌呤残基（O6），诱导DNA中的点突变，导致G:C到A:T的转换突变。对照组未暴露于EMS。所得到的平板在28 ± 2 ºC下孵育4 ± 1天。孵育后，计算三次重复中平板上获得的菌落数量。每组实验的菌落计数平均值用于绘制杀伤曲线(表一）。在EMS处理后能够在平板上生长的菌落被称为突变体。这些分离的突变体被接种在含有罗丹明红染料和羧甲基纤维素（PM-RB-CMC）的生产培养基上进行初筛。

表一 EMS杀伤曲线

      在EMS初筛过程中，作者共筛选了334个突变体，以识别与其亲本菌株相比最有潜力的纤维素酶产生突变体。这些突变体是基于在PM-RB-CMC琼脂培养基平板上纤维素水解区域的最大值来选择的。表现出区域大小与菌落大小的比值大于亲本菌株的分离物被称为较高的纤维素酶产生者。在334个突变体中，47个菌株展示了由区域比率（X-Y）/Y大于0.75 cm定义的明显的清晰区域。基于区域比率，最合适的EMS使用剂量是30 mg/mL。

表二 EMS最适使用浓度确定

      内切葡聚糖酶（尤其是羧甲基纤维素酶，CMCase）作用于纤维素链之间，最终释放出具有还原和非还原末端的小纤维素片段。作者测定突变体B3和D4分别产生了37和37.37 U/mL的CMCase活性，分别是野生型的3.02和3.05倍（图二）。B3和D4的特异活性分别为2.20和1.99（表4）。Irfan等人证明，菌株枯草芽孢杆菌K-18的最高酶滴定量为3.50 ± 0.11 IU/mL，在2%底物浓度、2%接种量、1%酵母提取物、pH 5.0、50 °C的孵化温度下，发酵周期24小时内获得。酸/碱处理的松针的酶解水解表现出酸处理的松针的糖化率为54.389%，证明了酶的有效性。Tandon等人报告了使用P. notatum-102产生的纤维素酶和木聚糖酶对NaOH + H2O2处理的松针的12.81%的水解率，这低于我们的结果。在这项研究中，我们观察到PASA处理的甘蔗渣的CMCase无细胞活性为37.37 U/mL，水解率约为49%。

图二 EMS诱变对纤维素酶改善的影响

表三 突变体的CMCase活性测定

      纤维素酶的主要组成部分是β-葡萄糖苷酶，它通过将纤二糖转化为葡萄糖来完成纤维素水解的最后阶段。作者在P. funiculosum 的334个突变体中共获得16个阳性突变体，其中由突变体D4产生的最高β-葡萄糖苷酶活性为32.1 U/mL，其蛋白产量也是最高，达18.81 mg/mL，较亲本菌株增加了2.67倍。作者进一步分析该突变菌株的批次发酵动力学参数，发现突变增加了D4突变体的FPase特异活性2.33倍，并分别提高了CMCase和β-葡萄糖苷酶的特异活性1.14倍和1.13倍（表四）。

表四 突变体的CMCase活性测定

      作者通过在40升规模发酵罐中利用乙基亚磺酸乙酯（EMS）诱导的突变体对P. funiculosum进行了纤维素酶的生产研究。作者发现酶和蛋白质的合成与菌株生长密切相关，且在优化的生物反应器操作条件下，即在220 rpm的搅拌速度和0.6 vvm的通气量下，纤维素酶的产量比非优化条件下提高了3.6至9.5倍。此外，与亲本菌株相比，酶活性提高了2倍至5倍，特别是D4突变体在分批培养中显著提高了发酵液中纤维素酶的活性。在40 L 深层发酵规模下达到了4.79 U/mL的FPase活性，而CMCase和β-葡萄糖苷酶分别达到了42.49 U/mL和21.17 U/mL。值得注意的是，突变体D4在第六天达到了最大的木聚糖酶酶活101.87 U/mL，并在第十天展现出了1.79 g/L/天的蛋白质生产率和479 U/L/天的FPase生产率。作者分析SDS-PAGE发现，突变体D4的分泌物中大约有九个蛋白质条带，范围在28 kDa到100 kDa之间，最强烈的条带在45 kDa到58 kDa之间。随后，作者通过切向流过滤（TFF）技术将粗外胞酶浓缩了1.40倍，使得FPase浓度从4.79 U/mL增加到了6.71 U/mL。作者的实验表明，通过对P. funiculosum进行EMS诱导突变，可以显著提高纤维素酶的产量和活性，为工业规模生产纤维素酶提供了有力的技术支持。

图三 D4突变体在40 L规模发酵罐中生产纤维素酶

     作者探讨了P. funiculosum EMS突变株产生的纤维素酶对未处理和PASA处理的蔗渣、稻草及玉米芯的木质纤维素生物质（LCB）水解能力，并与商业化酶进行了比较。作者发现，P. funiculosum D4突变株的仅使用粗酶液就能有效地将预处理的蔗渣、稻草和玉米芯糖化为可溶性糖，释放比例分别为3.54%、5.13%和4.54%。此外，作者应用协同作用原理和统计分析，发现P. funiculosum NCIM 1228的酶在不同剂量下对蔗渣、玉米芯和稻草的水解效率分别达到了54.03%、71.4%和76.87%，显示出优于先前研究的水解效率。这表明D4突变株的发酵液中已包含所需的酶混合物，无需额外配方，就可以成为高效水解LCB的未来选择。

图三 纤维素酶突变体与商业化纤维素酶的效率比较

      本研究中作者采用EMS诱变技术对P. funiculosum NCIM 1228进行突变文库的构建，并挖掘其中胞外纤维素酶活性高的多个突变体进行深入研究。最终，作者获得了一株相较于亲本菌株在FPase、CMCase、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活性方面分别实现了6.47倍、3.05倍、3.03倍和3.19倍的显著提升，展现了其在未来应用中的巨大潜力。随后，作者在40升规模水平进行发酵后，对优选的D4菌株分泌的纤维素酶进行了糖化效率评估，并将其与市售纤维素酶进行了比较。结果显示，突变体D4酶在甘蔗渣、玉米芯和稻草上的水解效率分别达到了54.03%、71.44%和76.87%，而市售酶的相应水解效率分别为53.07%、78.06%和78.66%。这些数据明确表明，作者筛选获得的突变菌株纤维素酶在效率上具有可观的竞争力。此外，与亲本菌株相比，EMS突变体D4在培养液中展现出了更高的胞外FPase、CMCase、木聚糖酶和蛋白质含量，这表明该菌株在大规模降低纤维素酶生产成本方面显示出巨大的潜力。此外，P. funiculosum D4突变体及其富含纤维素酶的粗酶提取物能够高效降解经预处理的木质纤维素生物质，无需对分泌物进行任何修改，这为未来生物资源处理提供了一种新的、高效的选择。

Chavan, S., Shete, A. & Dharne, M.S. Strain improvement for cellulolytic enzymes for effective saccharification of lignocellulosic biomass by mutant of Penicillium funiculosum NCIM 1228. Syst Microbiol and Biomanuf (2024). https://doi.org/10.1007/s43393-024-00247-x