计算机模拟研究探索木质纤维素的分解机制——系统微生物学与生物制造文章推荐

In silico studies of fungal xylanase enzymes: structural and functional insight towards efficient biodegradation of lignocellulosic biomass

计算机模拟研究真菌木聚糖酶：从序列和结构探索高效分解木质纤维素的机制

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https://doi.org/10.1007/s43393-023-00222-y

    木聚糖酶能高效分解木聚糖，将其转化为可用于食品、动物饲料、生物燃料、造纸等工业领域的发酵的糖类。研究团队通过分子建模和对接分析，选取了17种真菌物种的木聚糖酶和5种底物（D-木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖）进行实验，以识别活性位点残基和这些复合物的结合亲和力。

    在所有测试的真菌中，黑曲霉（Aspergillus niger）、Orpinomyces sp.、Neocallimastix patriciarum 和 Botrytis fuckeliana 表现出了最高的分子相互作用和对不同底物的结合亲和力。作者进一步选择这四种酶与底物结合进行模拟研究，以确定酶-底物复合物的稳定性。作者深度解析了Botrytis fuckeliana来源的木聚糖酶与木二糖的结合模式、N. patriciarum来源的木聚糖酶与木四糖的结合模式，了解了其在木聚糖降解过程中发挥的重要作用，以及其从木质纤维素生物质中生产生物乙醇的催化过程。这项研究不仅揭示了特定真菌木聚糖酶与底物间的高效结合机制，而且为利用木质纤维素生物质生产生物乙醇提供了重要的理论基础。

    在现代绿色工业中，木质纤维素、甘油三酯和糖类是三种重要的原料。其中，木质纤维素作为化石燃料的潜在替代品，在生物质转化领域中占据重要地位。高效生物降解木质纤维素的关键步骤是去除木质素并分解细胞壁中的纤维素和半纤维素。半纤维素主要由β-1,4-木聚糖和β-1,4-D-木糖吡喃苷残基组成，带有阿拉伯糖和乙酰基侧链，是细胞壁中仅次于纤维素的最常见多糖。

    木聚糖作为生物质资源，在多种工业过程中作为底物具有潜力，可以被木聚糖降解酶水解以产生木糖和木聚糖寡糖。通过木聚糖酶破坏木质纤维素中半纤维素的晶体结构，可以在去除木质素后提高半纤维素复杂聚合物向简单糖转化的速率。需要多种木聚糖降解酶来消化木聚糖，这些酶在碳水化合物活性酶（CAZy）数据库中被归类为基于氨基酸和结构特征相似性的糖苷水解酶（GH）家族10或11。GH家族10和11的木聚糖酶可用于包括造纸和纸浆制造、生物燃料、食品和饲料以及制药和医疗等多个领域。

    多种微生物，包括细菌和真菌，都能合成木聚糖降解酶；其中，工业生产木聚糖酶种最常见的底盘细胞是丝状真菌。Aspergillus和Trichoderma是两个主要的能产生耐热木聚糖酶的中温真菌属，而Chaetomium thermophile、Humicola lanuginose和Thermomyces lanuginosus等耐热真菌也被发现可以合成木聚糖酶。

    为了有效利用真菌木聚糖酶，增加木质纤维素生物质向替代生物燃料的生物转化率，对这些酶的作用机理进行深入了解是必要的。在蛋白质工程方面，这种深入的理解对于定制或改变底物选择性、酶活性和催化速率至关重要，以实现酶催化的最高可能转化率。为了更好地了解这些真菌木聚糖酶的结构特征，作者深入进行了对这17种真菌木聚糖酶的计算机模拟研究。

    作者从UniProt KB数据库中收集了17种不同真菌物种的木聚糖酶序列。为了研究这些真菌物种中的木聚糖酶酶序列的相似性，使用了MultAlin服务器进行多序列比对，探究了底物结合位点（如D-木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖）的序列保守性。

    通过对这些真菌物种的木聚糖酶氨基酸序列比对，发现底物结合位点在酶的N端和C端均表现出极高的差异性（图一）。但是作者发现在B. fuckeliana来源的木聚糖酶与木五糖结合位点中，Tyr113、Tyr124和Glu122显示出高度的序列保守性；同时在木二糖结合位点，B. fuckeliana的Tyr124也表现出高度保守性。而对于在黑曲霉来源的木聚糖酶结合位点Ala161，与D-木糖底物的序列保守性不明显，而Tyr214在整个序列比对中对D-木糖底物结合位点的保守性较低。

    Liao等人对不同真菌的六种木聚糖酶的研究显示，糖苷水解酶家族GH10和GH11含有相同的活性位点。这些发现有助于理解不同真菌木聚糖酶的底物特异性和酶活性，对于木聚糖酶的结构和功能关系研究，以及工业应用中木聚糖酶的开发和优化具有重要意义。通过深入分析木聚糖酶的结合位点保守性，可以揭示不同真菌物种中木聚糖酶的底物识别和催化机制的多样性，为定制特定底物的高效木聚糖酶提供理论依据和指导。

 图一 不同真菌种类木聚糖酶底物结合位点序列保守性分析

    作者进一步使用Mega 7.1软件中构建了一个矩形系统发生树，以展现17种真菌木聚糖酶的进化关系（图二）。根据系统发生树，作者发现Penicillium chrysogenum与Piromyces sp.的关系最为接近。同样地，B. fuckeliana与Hypocrea jecorina以及Ustilago maydis和Neocallimastix patriciarum分别与Talaromyces funiculosus和Piromyces sp.关系密切。许多真菌木聚糖酶在进化上达到了高度的一致性。Orpinomyces sp.和Gibberellazeae与其他真菌木聚糖酶相对独立。

    作者在本研究中发现17种真菌木聚糖酶之间存在微小的差异。Álvarez-Cervantes等人进行的类似研究发现，GH10和GH11家族中的木聚糖酶在系统发生树和序列比对中亲缘关系较远。这一系统发生分析结果不仅揭示了不同真菌木聚糖酶之间的亲缘关系，而且还提供了关于这些酶进化过程的重要线索。通过了解这些真菌木聚糖酶的进化背景，可以更好地理解它们的生物学特性，包括底物特异性、酶活性和稳定性。此外，这些信息对于进一步开发和改进工业应用中使用的木聚糖酶具有重要意义，特别是在改善酶的性能和适应性方面。

 图二 不同真菌来源木聚糖酶的系统发育树

    此外，作者进一步从蛋白质结构角度对不同来源的木聚糖酶进行分析，通过将每种真菌木聚糖酶的序列单独输入到蛋白质BLAST服务器中，进行了同源性搜索以用于模型构建。为了寻找最佳参考结构，利用PDB数据库进行模板搜索，基于查询覆盖率和序列同一性来确定。当序列与完美匹配的比较结构具有超过60%的同一性和超过60%的查询覆盖率时，即满足了同源建模的基本要求。同源建模是预测蛋白质三维结构的一个重要方法，特别是当目标蛋白质的结构尚未被实验方法（如X射线晶体学或核磁共振）解析时。通过这种方法，研究人员可以根据已知结构的蛋白质（即模板）来预测目标蛋白质的结构。作者选择与真菌木聚糖酶序列具有高度同一性和查询覆盖率的模板，是为了确保构建的模型与真实结构尽可能接近。

表一 真菌木聚糖酶同源序列的筛选和鉴定

    为确保建模后的木聚糖酶结构的准确性，作者在本研究中使用了MolProbity工具来验证模拟的木聚糖酶结构。MolProbity是一个结构验证工具，它采用了X射线晶体学、冷冻电镜（cryoEM）和核磁共振（NMR）中的原理，包括全原子接触分析（包括氢原子）、旋转异构体选择和Cβ偏差等特征。此外，ProCheck、WHATIF和ERRAT所提供的数据也被用作模型验证的标准，基于Ramachandran图的原则。模拟的真菌木聚糖酶在初始和细化后的MolProbity得分列在表二中。

表二 基于UCLA-DOE LAB-SAVES v6.0的对接优化模型及其最佳识别

    作者对17种真菌木聚糖酶进行了模型构建和验证。特别地，Magnaporthe grisea的木聚糖酶模型在所有模型中表现最为优秀。这些模型的残基百分比中，有92.1%至96%落在Ramachandran图（RC图）最受青睐的区域内。这一数据表明这些模型能够成功地生成紧密的二级结构内容，如α-螺旋和β-折叠。RC图验证显示，模拟的木聚糖酶酶最受青睐区域的百分比范围为90%至96%，这进一步证实了模型的高质量。RC图的受青睐区域被所有17个氨基酸模型所代表，表明这些模型的性质保持一致（图三）。

    这些结果说明，通过同源建模方法构建的木聚糖酶模型在结构上是可靠和有效的。落在RC图最受青睐区域的高比例表明，这些模型在预测蛋白质的二级结构方面具有高度的准确性。这对于理解木聚糖酶的功能和作用机制非常重要，因为蛋白质的二级结构对其活性和稳定性具有决定性影响。

图三 预测木聚糖酶精细模型和RC图

    作者进一步分析了预测的所有真菌木聚糖酶结构模型，发现它们均表现出典型的二级和三级结构，具有α/β构象折叠的三维构型。特别地，来源于诸如Neocallimastix patriciarum（625 aa）、Talaromyces funiculosus（407 aa）、Magnaporthe grisea（380 aa）、Talaromyces cellulolyticus（337 aa）、Penicillium chrysogenum（353 aa）、Piromyces sp.（606 aa）和Orpinomyces sp.（459 aa）等真菌的300个以上氨基酸序列的木聚糖酶，含有超过3个α-螺旋和β-折叠复杂结构。而氨基酸序列少于300的木聚糖酶来源微生物，如Gibberella zeae（228 aa）、Aspergillus niger（225 aa）、Hypocrea jecorina（223 aa）、Aspergillus oryzae（232 aa）、Botryotinia fuckeliana（226 aa）、Penicillium funiculosum（282 aa）和Ustilago maydis（221 aa），其三维结构中含有3个或更少的α-螺旋和β-折叠。

    这些结构特征对于理解木聚糖酶的功能和活性至关重要。α-螺旋和β-折叠的存在和数量直接影响蛋白质的稳定性和底物结合能力。酸性和碱性残基的比例则影响酶的电荷分布，进而影响其与底物的相互作用。通过深入研究这些结构特征，可以更好地理解木聚糖酶如何与其底物结合和催化反应，从而为改进木聚糖酶的设计和开发提供重要的理论基础和实践指导。

图四 比较将脂肪酶的观测值与模型预测值

    基于预测得到的高置信度模型，作者分析了真菌木聚糖酶与底物之间的分子相互作用。在N. patriciarum来源的木聚糖酶中，残基Gln83、Asn86、Asp469、Glu476和Glu642与木三糖底物发生了关键作用。例如，Gln83的侧链氧原子与木三糖的O3原子距离只有2.28 Å，推测会发生相互作用。而B. fuckeliana来源的木聚糖酶中，Tyr109、Glu122、Pro162和Gln172的侧链氧原子分别与木五糖和木二糖的O3原子存在2.74至3.15 Å的距离，作者认为它们之间也存在相互作用。此外，Orpinomyces sp.来源的木聚糖酶与木四糖底物之间，残基Trp174、Tyr201、Ser213、Asp249和Gly441的侧链原子与O3原子形成了2.54至3.51 Å的距离（图五）。

    这些分子相互作用的研究揭示了木聚糖酶如何与不同底物结合，对于理解这些酶的功能和优化它们的工业应用至关重要。通过这种深入的分子层面分析，可以为开发新的、更高效的木聚糖酶变体提供重要信息。

图五 木聚糖酶与配体之间的分子相互作用

    最后，作者使用Gromacs软件对五种真菌木聚糖酶与不同底物的复合物进行了100纳秒的分子动力学（MD）模拟。这些复合物包括A. niger与D-木糖、B. fuckeliana与木二糖和木五糖、N. patriciarum与木三糖、以及Orpinomyces sp.与木四糖。

    通过计算根均方偏差（RMSD），作者比较了这些复合物的结构稳定性。结果显示，A. niger与D-木糖、B. fuckeliana与木二糖和木五糖的复合物在模拟过程中保持了较高的稳定性，配体和木聚糖酶的距离波动较小。而N. patriciarum与木三糖、Orpinomyces sp.与木四糖的复合物表现出更大的距离波动，表明其结合稳定性较低(图六)。

    这些发现揭示了不同真菌木聚糖酶与其底物之间的相互作用强度和稳定性，对于理解木聚糖酶的功能和优化其工业应用具有重要意义。

图六 木聚糖酶-底物复合物模型分子动力学RMSD

    目前，为了高效制备生物乙醇产量，降解木质纤维素原料是一个关键步骤。使用微生物降解木质纤维素至生物乙醇在商业上是可行且有效的。作者在本研究中提供了关于B. fuckeliana来源的木聚糖酶与木二糖配体、以及N. patriciarum木聚糖酶与木三糖配体结合过程的更深入理解，这对后续对木聚糖酶催化活性改造至关重要。

    此外，作者通过分子动力学模拟分析，分析发现了与木二糖结合的B. fuckeliana来源木聚糖酶和与木三糖结合的N. patriciarum木聚糖酶复合物表现出较高的稳定性，其值在0.2-0.8 nm之间，相比其他复合物更为稳定。作者推测这两个来源的酶具有很高的促木聚糖分解的能力。

    这项研究拓展了对酶法降解木聚糖的分子机制的理解，这将有助于未来开发提高木质纤维素生物降解效率的策略。

Samantaray, B., Behera, R.R., Mishra, R.R. et al. In silico studies of fungal xylanase enzymes: structural and functional insight towards efficient biodegradation of lignocellulosic biomass. Syst Microbiol and Biomanuf (2023). https://doi.org/10.1007/s43393-023-00222-y