江南大学王小元教授团队的最新研究成果
代谢工程改造谷氨酸棒杆菌CGY-PG-304合成γ-氨基丁酸
在SMAB正式上线
原文链接
γ-氨基丁酸（GABA）是一种重要的非蛋白质氨基酸，在食品添加剂、饲料加工、化妆品制造及医疗健康等领域应用广泛，市场需求量日益增加。谷氨酸棒杆菌作为食品安全级菌株具有代谢路径明确及L-谷氨酸合成能力强的优点，是通过微生物发酵法利用葡萄糖从头合成GABA的理想菌株。江南大学王小元教授团队通过代谢过程改造，构建了一株利用葡萄糖高产GABA的谷氨酸棒杆菌，GABA产量达到112.03 g/L。
研究背景
前期研究中，王小元教授团队通过在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中敲除乙酸、乳酸、L-丙氨酸合成相关基因ldh、eutD、poxB、pknG，敲除gabTDP切断GABA分解代谢路径，同时表达来自乳酸菌LB85的谷氨酸脱羧酶基因gadB2，构建了菌株CGY-PG-304，经补料分批发酵GABA产量达到58.3 g/L。为了进一步挖掘该菌株的GABA生产潜力，王小元教授团队通过削弱α-酮戊二酸的消耗、改变细胞膜壁结构中分枝菌酸结构、加强柠檬酸到异柠檬酸的碳通量等策略来积累L-谷氨酸，从而使GABA产量和生产效率得到进一步提高（图1）。
图1 代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成GABA
科学发现
为了提高CGY-PG-304中GABA合成前体L-谷氨酸的积累，首先探究了改变分枝菌酸结构及削弱TCA循环中α-酮戊二酸的消耗对GABA合成前体L-谷氨酸积累的影响。在出发菌株CGY-PG-304中分别敲除sucCD、cmrA、treY，并30℃、32℃和34℃ 三种温度下进行了发酵。出发菌株CGY-PG-304在提高发酵温度后L-谷氨酸和GABA的产量均有所提高。在32℃条件下，sucCD缺失菌株CGW001中GABA产率比出发菌株提高了6.17%。在32℃条件下，cmrA缺失菌株CGW002和treY缺失菌株CGW003中GABA产量分别为37.79 g/L和42.44 g/L，比出发菌株分别提高了10.98%和26.99%。上述实验说明：sucCD缺失能够削弱α-酮戊二酸的消耗提高GABA的产率，cmrA和treY缺失通过改变分枝菌酸层结构导致L-谷氨酸积累从而提高GABA产量。另外，发酵温度32℃有利于产物GABA的合成，发酵温度34℃有利于前体L-谷氨酸的积累。
图2 谷氨酸棒杆菌 CGW004、CGW003/pE-gltS、CGW003- pE-acnA和CGW005摇瓶发酵
在32℃条件下，分别敲除sucCD、treY、cmrA，以及组合敲除treY和cmrA（CGW004）均可提高GABA产量，其中CGW003菌株产量最高，但在发酵结束后胞外仍有部分L-谷氨酸没有被利用。针对这种情况，一方面，在重组菌株CGW003中过表达编码钠偶联的L-谷氨酸二次摄取系统的基因gltS；另一方面，在CGW003中过表达顺乌头酸酶拉动TCA循环中从草酰乙酸到α-酮戊二酸的碳通量积累L-谷氨酸。经过72 h摇瓶发酵，gltS表达菌株CGW003/pE-gltS GABA产量达到44.22 g/L，胞外的L-谷氨酸比对照菌株CGW003减少了37.12%；acnA表达菌株CGW003/pE-acnA中GABA产量达到45.38 g/L，比出发菌株提高了35.79%（图2）。为了维持acnA能够在发酵过程中稳定的过表达，将菌株CGW003染色体上acnA启动子替换为强启动子PtacM，从而发酵时无需添加抗生素和诱导剂，经过摇瓶发酵，GABA产量达到46.91 g/L（图2）。
对重组菌株CGW005在7.0 L生物反应器中通过两阶段pH调控的方式进行了96 h补料分批发酵，最终GABA产量为112.03g/L，生产效率为1.17g/L/h，葡萄糖转化率为0.34 g/g（图3）。
图3 谷氨酸棒杆菌CGW005生物反应器补料分批发酵
总结展望
作者通过优化膜壁分枝菌酸成分和代谢工程改造合成GABA碳流，构建了能够高效生产GABA的谷氨酸棒杆菌CGW005。在7.0 L生物反应器中，CGW005 的GABA滴度达到112.03 g/L，葡萄糖产量为0.34 g/g。该研究为更好地提高GABA产量提供了新策略。
引用方式
Yang Wang, Chengzhen Yao, Danyang Huang, Hedan Li, Ying Li, Ziwei Liu, Benzheng Zhou, Xiaoqing Hu, Xiaoyuan Wang. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum CGY-PG-304 for promoting gamma-aminobutyric acid production. Systems Microbiology and Biomanufacturing, 2024, https://doi.org/10.1007/s43393-024-00236-0.
王洋，江南大学生物工程学院2021级硕士研究生，微生物学专业。
王小元，江南大学生物工程学院教授。
Systems Microbiology and Biomanufacturing(系统微生物学与生物制造，简称SMAB，ISSN：2662-7655) 是由江南大学主办，Springer Nature出版集团出版的英文期刊。期刊SMAB致力于为工业微生物与生物制造过程领域的新发现、新方法和新技术提供报道的平台，由江南大学徐岩教授和Bioresource Technology期刊原主编Ashok Pandey教授共同担任本刊主编，编委分布于全球近20个国家，更多内容详见期刊主页。
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