江南大学吴志猛教授团队的最新研究成果
分子动力学模拟助力OGT伪底物多肽抑制剂的开发研究
在SMAB正式上线
原文链接
https://link.springer.com/article/10.1007/s43393-023-00168-1
O-GlcNAc糖基化修饰的异常表达与肿瘤发生发展密切相关，因此OGT（O-GlcNAc糖基转移酶）被认为是相关抗肿瘤药物开发一个潜在靶点。然而，现有OGT抑制剂亲和力低、特异性差、体内活性不佳，尚难以满足以OGT/O-GlcNAc为靶点的抗肿瘤研究。OGT对其多肽底物序列具有较强的选择性，基于OGT与多肽底物相互作用机制有望可以开发高选择性的OGT抑制剂。借助构象动力学的可观察值采样分析手段探究OGT与多肽底物的动态相互作用，有助于加速基于OGT伪底物策略新型选择性抑制剂的高效精准设计和开发。
研究背景
O-GlcNAc糖基化修饰是一种广泛存在于真核细胞核质蛋白的可逆翻译后修饰机制。O-GlcNAc糖基化控制蛋白质的功能活性、稳定性、细胞定位、相互作用，进而精准调控细胞内基因表达、细胞周期、信号转导等关键生物学事件，在维持机体稳态中发挥重要作用。与之相反，异常活跃的O-GlcNAc糖基化与肿瘤等慢性疾病的病变过程密切相关。临床样本研究表明，包括结直肠癌在内的多种肿瘤组织中OGT及O-GlcNAc糖基化修饰的表达显著高于癌旁组织，与相关肿瘤患者总体生存预后较差显著相关，是一个潜在的肿瘤治疗靶点。通过化学抑制剂及基因敲除等手段下调O-GlcNAc糖基化均已展现出一定的肿瘤细胞增殖抑制潜力。现有OGT抑制剂主要为OGT糖供体底物UDP-GlcNAc的相关类似物及通过高通量筛选获得的小分子抑制剂。然而，UDP-GlcNAc并非OGT的专一性底物，其类似物难以满足对OGT抑制剂特异性的要求。现有多数OGT抑制剂存在亲和力低、水溶性差、细胞穿膜能力低等问题，且局限于早期的体外研究。
科学发现
作者基于OGT对底物多肽序列的高度选择性，通过深入探讨OGT与底物的相互作用动态变化，理性设计OGT伪底物抑制剂，为OGT特异性抑制剂的研究提供了新的思路。通过MD模拟OGT-ZO3S1（底物多肽）复合物在温度升高时的OGT多肽底物相互作用动态行为，探讨了ZO3S1多肽以及OGT蛋白的构象动力学特征在ZO3S1和OGT之间相互作用中的重要作用。基于动态模拟、构象采样和不同温度比对的深入分析，确定了影响OGT及其多肽底物相互作用的不稳定因素，提出了优化伪底物抑制剂亲和力的关键突变。
首先，结合OGT蛋白晶体结构及其对肽底物序列的选择性，作者构建了OGT-ZO3S1复合物的结构模型（图1A）。借助MD方法，深入分析了OGT与其多肽底物ZO3S1之间的结合动态行为，以探索影响OGT与肽底物稳定结合的不利因素。针对OGT-ZO3S1复合物在温度升高时的动力学参数进行采样（图1B、C、和D），包括ZO3S1分别在300 K和350 K条件下的回旋半径Rg、空间构象以及各个残基的均方根波动（RMSF）值，作者发现温度升高显著影响ZO3S1肽的空间构象，且高温条件下ZO3S1肽主链Rg具有更宽的分布范围。值得注意的是，随着温度的升高，ZO3S1肽中间R9残基以及C端S15残基的RMSF值显著增加（分别为1.7 Å和1.9 Å），表明R9和S15残基是OGT于底物结合的不稳定因素。
图1 OGT-ZO3S1复合物的构建和MD模拟。（A）OGT-ZO3S1复合物的模型构建；ZO3S1分别在300 K和350 K温度条件下的主链Rg分布（B）、代表性构型位移（C）、各个残基的RMSF值变化（D）。
然后，基于OGT与ZO3S1残基间相互作用距离的采样分析，作者发现：（1）在300 K时，OGT底物结合口袋中的四个带电残基K440，H471，H509和K644主要与ZO3S1多肽C端的S15残基接触；（2）温度升高后（350K），OGT底物结合口袋内的残基间接触发生重排。残基H471与S15的接触减少，而H509和K644与S15的接触增加；（3）温度升高时，OGT自身结构也产生波动性变化。在四个带电残基中，H509随着温度升高RMSF值发生较大的提高。由于多肽构象变化与上述相互作用之间并未表现出直接相关性，作者推测OGT的H509残基与ZO3S1的S15残基之间的相互作用是影响两者稳定结合的关键不利因素。因此，从ZO3S1多肽中去除该不利残基接触能够增加其与OGT的相互作用，其表现为OGT对该多肽的糖基化活性增强。
图2 温度升高时ZO3S1-S15残基在OGT底物结合口袋的接触重排。（A）OGT底物结合口袋内带电残基与S15的接触示意图；（B）OGT的四个带电残基在温度升高后的△RMSF值，以及在不同温度下与S15的残基间接触距离分布（D）。
最后，作者通过实验手段比较了OGT对野生型底物多肽ZO3S2和突变型底物多肽ZO3SM（S15A）的糖基化活性。结果表明，OGT对ZO3SM的糖基化活性是对照野生型多肽ZO3S2的1.7倍，证明消除S15与OGT的接触的确有利于两者的稳定结合。作者进一步将S13A和S15A同时突变，化学合成制备得到ZO3SP（RVPSAQA）作为伪底物抑制剂，其OGT酶活性抑制IC50值为192.9 μM。O-GlcNAc糖基化免疫印记实验证明，ZO3SP仅在浓度达200 µM时能轻微地下调两种癌细胞中的O-GlcNAc糖基化水平，而在ZO3SP的N端添加穿膜序列的RRRRRVPSAQA多肽在20 µM浓度下即可显著抑制两种细胞内的O-GlcNAc糖基化水平，并且呈现浓度依赖效应。上述结果表明，伪底物肽（ZO3SP）对OGT具有良好的抑制作用，具有进一步开发为高选择性OGT抑制剂的潜力。
图3 突变型底物和伪底物抑制剂的实验验证。UDP-Glo法测定野生型肽（ZO3S 2）和S15A（ZO3SM）突变体的OGT活性（A）；（B）伪底物ZO3SP（S13A和S15A突变）对OGT活性的抑制作用；免疫印迹法分析伪底物抑制剂对HCT116（C）和LoVo（D）细胞内总蛋白O-GlcNAc水平的影响。
总结展望
作者从OGT对底物多肽的高选择性出发，通过MD模拟策略对OGT与受体底物多肽ZO3S1的动态结合行为进行了深入的分析，讨论了在温度升高时结合口袋内不利的残基间接触，特别是OGT的H509残基和多肽底物S15残基之间的接触。基于上述发现，作者首次设计并合成了OGT伪底物多肽抑制剂，考查了OGT伪底物抑制剂的体外OGT抑制效果以及抗肿瘤活性。该研究为基于OGT与肽底物动态相互作用的OGT选择性抑制剂理性设计提供了重要的模型和基础，对进一步推进以OGT为靶点的抗肿瘤研究具有重要意义。
引用方式
Qin, X, Shi, J, Li, X. et
al. Optimizing the binding of OGT and a peptidic substrate towards
pseudo-substrate inhibitors via molecular dynamic simulations. Syst
Microbiol and Biomanuf (2023). https://doi.org/10.1007/s43393-023-00168-1
覃薪方，江南大学生物工程学院2020级硕士研究生。
吴志猛，江南大学生物工程学院教授，团队基于糖化学生物学、发酵工程、蛋白质工程和免疫化学等交叉学科背景，致力于肿瘤和细菌糖类疫苗、纳米抗体介导的肿瘤免疫治疗和抗体偶联药物研究；先后主持完成国家级、省部级及行业委托项目10余项；在国际主流期刊以第一和通讯作者发表学术论文50余篇；授权发明专利10项。已指导毕业博士研究生5人，硕士研究生15余名。兼任中国化学会糖化学分会委员和江苏省免疫学会转化医学常务委员，国内外多个期刊审稿人和基金组织的评审专家。
吕成，长期从事蛋白质设计与工程的研究，主要承担《蛋白质工程》、《生物信息学》课程的讲授工作。近年来共发表高水平研究论文14篇；主持包括国家自然科学基金青年基金、江南大学自主科研项目在内的省部级科研项目2项；指导学生参加全国大学生生命科学竞赛获三等奖2项；现为江苏省“双创博士（2017）”。
Systems Microbiology and Biomanufacturing(系统微生物学与生物制造，简称SMAB，ISSN：2662-7655) 是由江南大学与Springer Nature出版集团合作主办的英文期刊。期刊SMAB致力于为工业微生物与生物制造过程领域的新发现、新方法和新技术提供报道的平台，江南大学副校长徐岩教授担任主编，Bioresource Technology期刊主编Ashok Pandey教授担任期刊首席顾问，更多内容详见期刊主页。
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