紫色杆菌素的发酵生产——系统微生物学与生物制造文章推荐

A strategic media engineering and fed-batch approach enhances violacein production by Chromobacterium violaceum MTCC2656

紫色素杆菌高产紫色杆菌素的发酵工艺研究

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https://doi.org/10.1007/s43393-023-00230-y

    紫色杆菌素（violacein），作为一种由特定细菌系统自然合成的次级代谢产物，被发现具有抗微生物、抗肿瘤等多重生理功能，并因其潜在的应用价值在生物医药领域引起了广泛关注。尽管如此，当前紫色杆菌素的规模化生产及商业化应用严重掣肘于其低产量问题。作者在本研究中致力于通过优化培养基配方和开发高效的发酵策略来提升紫色色杆菌Chromobacterium violaceum MTCC2656生产紫色杆菌素的能力。通过系统筛选碳、氮源并优化其含量，以及对培养基中微量营养元素的两级统计优化，作者最终确立了最佳的培养基组分含量。另外在分批发酵工艺优化方面，作者采用葡萄糖与色氨酸的脉冲式补充及优化的培养液收获策略，每轮发酵实现了1046 ± 16 mg/L的紫色杆菌素产量和26.12 ± 0.64 mg/L/h的生产效率，相比之前提升了约5倍。同时，作者建立的发酵动力学模型分析进一步揭示了在发酵过程中如何精确控制底物消耗来进一步提高紫色杆菌素的发酵效率，为紫色杆菌素的高效生产和商业化应用提供了重要的理论依据和技术支持。

图一 培养基优化提升紫色杆菌素产量策略

      作者首先逐个探索了发酵培养基中营养成分，由于碳和氮源是细胞生长和维护所必需的关键组分。作者在培养基中使用复杂氮源时，由于其富含色氨酸（紫色杆菌素的已知前体），使用蛋白胨时观察到最高的紫色素产量达到98.66±0.17 mg/L。作者发现虽然所有复杂氮源的生物量产量相当，但在任何复杂氮源中生物量中的紫色杆菌素的含量都未超过8%（w/w）。作者推测复杂氮源由于含有多种氨基酸、维生素和生长促进剂的混合物而可能导致代谢流向整体细胞生长，从而使紫色素含量降低，所以通过代谢工程或限制培养基中其他氨基酸的含量，可以将代谢导向紫色素生物合成。因此，作者进一步测试了简单氮源对紫色杆菌素生产的影响。作者发现尿素是唯一一种能够支持该细菌生长的简单氮源，并且生产的紫色杆菌素浓度最高，达到了229.51±29.91 mg/，紫色杆菌素含量为19.12±2.49%（w/w生物量），这是复杂氮源中观察到的最高含量（酪蛋白胨—7.71±3.24% w/w生物量）的3倍。不同于复杂氮源，含尿素的培养基缺乏过多的生长因子，这导致代谢流向色氨酸的同化，这是培养基中唯一丰富的氨基酸。因此，作者认为细胞能更多地驱动色氨酸向紫色杆菌素生产的方向进行。这是首次报道使用尿素作为氮源在培养基中培养C. violaceum并生产紫色杆菌素的例子。由于尿素的成本远低于其他复杂氮源，这种培养基将在成本经济上更有利于紫色杆菌素的生产。

      此外，作者在测试的不同碳源时发现，葡萄糖和甘油也被证实支持C. violaceum的生长。这两种碳源在所有测试的碳源中产生了紫色杆菌素的浓度是最高的。而果糖则仅支持生物体的生长。除了单糖之外，作者认为一些无法被利用的碳水化合物是因为细菌缺乏对应葡萄糖苷酶的基因。因此，作者认为葡萄糖和甘油是作为紫色杆菌素生产的最合适碳源，并这两种碳源分别进行了进一步的优化研究。

图二 C. violaceum 培养基优化策略

      另外，作者继续在发酵培养基中优化其碳氮比，发现无论是碳源为葡萄糖还是甘油的情况下，当C/N比例为0.5 (w/w)时紫色杆菌素的产量都很高。

      作者进一步在C/N比例固定为0.5 (w/w)时，进一步调整尿素和葡萄糖/甘油的浓度。作者发现10 g/L的尿素浓度可以实现紫色杆菌素的高效生产。无论是葡萄糖还是甘油，当单独测试时，均在5 g/L时产生最多的紫色杆菌素。因此，作者在这浓度限定基础上开展研究。通过这一系列关于碳和氮源的实验，作者使得紫色杆菌素的产量从98.66±0.17 mg/L显著增加到199.73±0.73 mg/L，而紫色杆菌素在生物量的比例也增加到了16.9% (w/w)，这是最初含量5.03±0.25 (w/w)的约3.5倍。这些实验结果明显表明，通过优化发酵培养基中的碳氮比例和浓度，可以显著提高紫色杆菌素的生产效率。

表一 碳源及尿素浓度对紫色素发酵生产的影响

      随后，作者进一步通过统计分析方法优化培养基组分，对除碳源和氮源外的基础培养基中剩余的9种成分进行了调整，这些成分包括代谢增强剂、辅因子、生长必需物和缓冲剂。作者通过Plackett-Burman设计进行了12次实验，筛选出对紫色杆菌素产量影响显著的培养基成分。统计分析结果显示ZnSO₄·H₂O、MgCl₂、FeSO₄·7H₂O和色氨酸对紫色素的生产有显著正向效应。作者随后对这四种成分的浓度根据面向中心复合设计(FCCD)进行了进一步的优化，验证了它们对紫色杆菌素产量的显著影响。色氨酸作为紫色杆菌素的前体，在预测和实验中都观察到了其对产量的正向影响。同时，ZnSO₄·H₂O、MgCl₂和FeSO₄·7H₂O作为各种细胞功能（如跨膜运输和酶反应）的调节剂和辅因子，对提高紫色杆菌素的生产具有重要作用。此外，研究还发现K₂HPO₄增加时对紫色杆菌素产量有轻微的负面效应，这与培养基pH值的变化有关。L-蛋氨酸和维生素B12对C. violaceum的生长和维持至关重要，它们在培养基中的存在促进了细胞增殖和生物量的增加。作者通过FCCD优化证实了这些成分对紫色杆菌素产量的显著影响，为这种次级代谢产物的生产提供了重要的代谢需求与产量关系的见解。

图三 紫色杆菌分批发酵动力学

      作者进一步尝试利用优化紫色杆菌素生产的发酵工艺。通过观察C. violaceum的生物质积累与紫色杆菌素的生产，以及葡萄糖和色氨酸的利用情况，作者发现了一些独特的细胞生长和代谢活动特征。在生物质积累的对数期，即最初16小时内，葡萄糖的消耗速度呈指数级增长，与此同时，生物质的产生显著增高。相比之下，色氨酸在对数期的消耗速度较慢。在16至48小时内，伴随着色氨酸的积极摄取，紫色杆菌素的产生显著增加，生产速率在此期间达到最高。这表明，在发酵培养基中碳源和氨基酸的优先和序贯消耗是由细菌的能量需求所决定的。作者还发现，通过补充色氨酸可以显著提高紫色素的产量。到分批发酵末期，葡萄糖和色氨酸的残余水平降至最低，表明这些培养基组分已被最大程度消耗。最终，不添加色氨酸的紫色杆菌素产率为0.11 mg紫色杆菌素/g葡萄糖，而添加了色氨酸的紫色素产率为0.89 ± 0.04 mg紫色杆菌素/mg色氨酸。

图四 紫色杆菌分批补料发酵的生长曲线

      作者进一步根据研究数据，通过比较半连续发酵中不同收获体积比下紫色杆菌素的产量与生物量积累之间的相关性，发现在60%体积比的培养基收获条件下，紫色杆菌素产量在第二和第三周期分别增加了33-38%，而40%体积比收获条件下的第二周期紫色杆菌素产量增加约29%，但在第三周期减少至20%，同时生物量积累也受到显著影响。在80%体积比收获条件下，第二周期的紫色杆菌素产量显著降低，据此选择60%体积比收获作为重复给料批次培养的最优条件。通过采用优化后的多营养脉冲给料策略进行半连续发酵，实现了每40小时收获一次的情况下，紫色杆菌素的产量达到1045.65±15.72 mg/L，生产率为26.12±0.65 mg/L/h，此外，基于葡萄糖生产的生物量产率为0.37±0.001 (g/g)，基于色氨酸生产的紫色杆菌素产率为1.56±0.03 (mg/mg)。与现有文献比较，作者通过结合添加色氨酸和葡萄糖及优化收获时机的策略，不仅实现了与已报道的克级紫色杆菌素生产相当的产量，而且将紫色杆菌素的生产率提高至26.13±0.65 mg/L/h，是目前报道中最高的生产率。此项研究强调了通过精细调控发酵过程参数以优化特定代谢产物产量的重要性，为微生物治疗化合物的高效生产提供了有力的技术支撑。

表二 发酵液收获率对紫色杆菌生产及生物量的影响

      作者在本研究中成功实现了高价值生物活性化合物紫色杆菌素的克级别生产，显著提高了其生产效率。作者进一步在发酵动力学模型方面研究了批次发酵和补料批次发酵的生物量积累，并采用对数-对数模型、Gompertz模型及剂量-反应模型进行非线性拟合，其中剂量-反应模型以0.991的高COD值准确预测了生物量积累的动力学参数。通过将模型扩展为双剂量-反应模型，研究了脉冲给料策略，作者发现在多营养脉冲给料和60%体积比发酵液收获的条件下，第二和第三周期的生物量积累显著提高，这与周期启动时较高的初始生物量浓度密切相关。而在基质利用动力学的研究中，作者使用指数衰减模型和Weibull模型来动态分析残留葡萄糖浓度，其中指数衰减模型以0.807的R²值表现出较好的拟合度。相比之下，色氨酸的消耗呈现S型曲线，通过逻辑模型的拟合，作者得出了较为准确的消耗色氨酸速率，进一步证实了在复杂的生物发酵过程中，精确的动力学模型对于优化生产过程和提高生产效率的重要性。

图五 紫色杆菌在分批补料中的发酵动力学

表三 双剂量响应模型的实验及动力学参数预测

      在这项研究中，作者通过对紫色杆菌C. violaceum MTCC2656的培养基进行优化和采用分批补料发酵的策略，成功提高了紫色杆菌素的生产率，将其产量提高了约5倍，达到了1046±16 mg/L，表现了其显著的商业应用潜力。作者不仅对培养基中的碳源和氮源的含量进行了优化，还通过统计方法对微量营养物进行了调整，实现了紫色杆菌素的生产最大化。此外，作者进一步优化了分批补料发酵策略实现了在连续发酵周期中的高效生产。

      这一突破性的研究展现了培养基优化工程和分批补料发酵优化策略在天然产物生产上的重要应用，为紫色杆菌素等具有重要生物活性物质的商业化生产铺平了道路。展望未来，这项研究的方法和策略可以应用在更多生物活性物质的高效生产上，进一步推动生物技术在医药、化工等领域的应用发展。

Gharat, K., Singhal, R.S. A strategic media engineering and fed-batch approach enhances violacein production by Chromobacterium violaceum MTCC2656. Syst Microbiol and Biomanuf (2024). https://doi.org/10.1007/s43393-023-00230-y