美国波士顿学院Chestnut Hill团队最新研究成果
Recycling spent animal cell culture media using the thermally resistant microalga Chlorella sorokiniana
利用耐热微藻小球藻实现废弃细胞培养基的再利用
原文链接
https://doi.org/10.1007/s43393-024-00280-w
细胞培养是生物技术和制药领域的重要环节，但其细胞培养基往往具有高昂的成本和丰富的营养。作者在本研究中旨在通过利用藻类对使用过的细胞培养基进行处理，从而降低藻类发酵的生产成本。C. sorokiniana是一种耐热的微藻物种，在哺乳动物细胞培养基（GM）中显示出异养和混合营养生长的能力。于是作者分析了其在培养了鹌鹑肌原细胞（QM7s）四或八天的细胞培养基（4D-SGM和8D-SGM）的表现情况。作者发现与新鲜培养基相比，C. sorokiniana在4D-SGM中的生长显著增加，同时在72小时内，C. sorokiniana处理后的4D-SGM中氨和葡萄糖被完全清除。随后，将C. sorokiniana处理后的培养基重新用于QM7细胞培养，发现细胞在处理后的培养基中无毒性，并且代谢活性显著高于未处理的用过培养基。根据以上结果作者认为，C. sorokiniana可以在使用过的培养基中生长，并可能继续延长培养基的使用寿命，从而使生物加工过程更加经济。
图一 C. sorokiniana连续处理动物废弃培养基
研究背景
现代动物细胞生物加工产品具有解决全球制药和食品安全问题的潜力，包括单克隆抗体、细胞疗法、植物组织工程和人造肉培养等技术。例如，人造肉培养技术的开发不仅可能实现各类可持续发展目标，还能减轻传统畜牧业对环境的负担。然而，这些技术的高成本和有限的可及性限制了其大规模应用。以CAR-T疗法为例，2018年的初期药物成本高达37.3万美元。同时人造肉产业尽管已有一些工艺获得了监管批准，但截止2023年，美国市场上仍缺乏经济上具有竞争力的培养肉产品。因此，开发创新且具有成本效益的规模化动物细胞培养策略至关重要。其中，细胞培养基是支持动物细胞生长和代谢的关键因素，但其高成本和废弃再利用问题是主要挑战。微藻，如C. sorokiniana，因其在不同环境条件下的代谢可塑性和氨处理能力，可能具有在废弃动物细胞培养基中去除氨的潜力，从而延长培养基的使用寿命并降低生产成本。作者通过将C. sorokiniana与动物细胞共培养，来研究其在37°C环境下的生长表现及氨去除效率，并评估了处理后的培养基对动物细胞代谢活性的影响，以期设计连续处理废弃培养基的系统，最终实现降本增效，进一步推动细胞培养相关工艺的可持续发展。
科学发现
在研究C. sorokiniana对光强度的生长响应之前，作者首先确定了其基础生长动力学。将C. sorokiniana接种到新鲜的GM培养基中，并在不同光强度条件下培养四天。作者发现到第四天时，藻类生长速度明显减缓或停止。在光强度为165和13 µmol/m²/s条件下，最终藻类密度分别为0.23 ± 0.08和0.46 ± 0.10；在光强度为28和13 µmol/m²/s条件下，最终密度分别为0.41 ± 0.10和0.46 ± 0.10（图1b）。此外，鉴于许多藻类可以异养生长，作者将藻类接种到GM培养基中，并分别在光照（60 ± 5 µmol/m²/s）和黑暗条件下培养7天。在第三天时，作者发现无论是光照还是黑暗条件下，C. sorokiniana生长均达到稳定期，但是黑暗条件下培养的C. sorokiniana生长强度是光照条件下的两倍多，其生长速度也约为光照条件下的两倍。
图二 不同光照强度下C. sorokiniana的生长。
随后作者在QM7细胞生长的8天过程测定了培养基中葡萄糖和氨浓度。四天后，培养基中的总葡萄糖浓度从3 g/L下降至0.95 ± 0.08 g/L，而到第八天时进一步降至0.12 g/L。而培养基中的总氨浓度从在第八天时升高到的1.90 ± 0.10 mmol/L。
图三 QM7细胞生长8天中培养基总葡萄糖和氨水平
作者将C. sorokiniana接种到 TAP 培养基、GM、4D-SGM、8D-SGM 和 BG-11 培养基中，并在 37°C、60 ± 5 µmol/m2/s 光照下培养七天。明场图像显示，C. sorokiniana细胞壁完整，具有典型的绿色叶绿体，荧光叠加图像则显示出七天后在动物细胞 GM 中生长的藻类细胞具有叶绿素自发荧光。培养三天后，作者比较了所有组别中的细胞生长，与GM 组相比，TAP 和 4D-SGM 组的细胞生长量约为其三倍。TAP 和 4D-SGM 组的生长持续到第六天。虽然 8D-SGM 组的C. sorokiniana在第七天的产量与 4D-SGM 组相同，但生长动力学明显不同。总体来看，七天内 TAP、4D-SGM 和 8D-SGM 组的藻类生长速率和产量显著高于 GM 组（图四）。
图四 C. sorokiniana在不同培养基的生长。
作者随后将C. sorokiniana以两种不同的初始细胞密度接种到4D-SGM中，在接种密度较低的培养物中观察到约一天的滞后期。作者发现在接种后的第一天，各接种组的氨和葡萄糖含量均有所下降，其中接种量为108个细胞/mL组的去除率显著更高，而接种量为107个细胞/mL组的去除率较低。尽管高接种量组的葡萄糖消耗速率更高，但在第三天时，两组的培养基中的葡萄糖和氨均已完全被代谢。
图五 两种接种密度比较葡萄糖和氨的消耗。
作者发现接种到各组培养基中的C. sorokiniana随时间显示出显著的生长速率差异（表一）。前三天培养中，在葡萄糖浓度最高但氨浓度最低的GM与含少量葡萄糖但氨浓度最高的8D-SGM中培养的生长状态相近。而第三天后，C. sorokiniana在8D-SGM中的生长继续，而GM中的生长则下降。这表明，高浓度葡萄糖不一定能保证C. sorokiniana的长期生长（超过三天）。作者认为氨和光照的存在会使C. sorokiniana在动物细胞培养基中的生长更持久。这些结果表明，在动物细胞培养基中，氨和葡萄糖的组合比单独存在氨或葡萄糖更能促进初期生长。尽管4D-SGM中C. sorokiniana的细胞密度较高，但在第三天后其密度下降，而在8D-SGM培养则可以在整个实验过程中表现出持续的生长。
表一 各类细胞培养液中的C. sorokiniana生长速率
最后，作者探究了QM7细胞在C. sorokiniana处理后培养基中的生长进行了详细研究。首先，作者发现C. sorokiniana在含酚红的GM培养基中培养后，滤除藻类后培养基依然呈粉红色，说明pH值未发生显著变化。为了进一步评估C. sorokiniana处理后的再利用GM的细胞毒性，作者通过活/死细胞分析，结果显示QM7细胞在新鲜GM与C. sorokiniana处理后GM中培养时的生长状态之间没有统计学上的显著差异。此外，在比较QM7细胞在GM、8D-SGM和C. sorokiniana处理后的8D-SGM培养基中培养一天后的代谢活性时，作者通过MTT检测发现，新鲜GM与藻类处理8D-SGM培养的细胞代谢活性无显著差异，而在8D-SGM培养基中培养的QM7细胞代谢活性显著降低（图六）。
图六 QM7细胞对海藻处理的培养基的反应
总结展望
生物加工技术的进步使食品和制药行业的许多产品生产更加经济高效。然而，细胞制品和细胞疗法等新一代食品和药物的经济批量生产仍面临挑战。为使这些技术普及并使得普通民众负担得起，开发新的生产工艺策略迫在眉睫。作者在本研究中探讨了C. sorokiniana与动物细胞共生培养以改进实验室培育肉类的生物加工。作者发现，采用异养生长的C. sorokiniana设计细胞废弃培养基回收系统，可以最大限度的重复利用废弃的细胞培养基，而且C. sorokiniana处理后的动物细胞培养基无明显细胞毒性。综上所述，作者在本研究提出了一种通过C. sorokiniana微藻反应器去除培养基中氨实现再循环的新型生物加工过程，具有细胞培养技术未来在工业生产上降本增效的潜力。
引用方式
Thyden, R., Dominko, T., Weathers, P. et al. Recycling spent animal cell culture media using the thermally resistant microalga Chlorella sorokiniana. Syst Microbiol and Biomanuf (2024). https://doi.org/10.1007/s43393-024-00280-w
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