韩国蔚山国立科学技术研究院Sung Kuk Lee
团队最新研究成果
Enhancing translation efficiency and exploring constraints in high-level 4-hydroxyvaleric acid production from levulinic acid in Escherichia coli
大肠杆菌高效生产4-羟基戊酸中的生产瓶颈翻译效率强化探索
原文链接
https://doi.org/10.1007/s43393-024-00258-8
4-HV（4-羟基戊酸）在生物降解材料和生物燃料领域具有广阔应用前景。作者在本研究中针对4-HV的高效生产进行了探索，创制了一种无需抗生素、基于底物诱导的大肠杆菌细胞工厂，以乙酰丙酸为底物合成4-HV。作者通过优化核糖体结合位点实现了关键酶的有效表达，显著提高了4-HV的生产效率。在连续补料发酵中该工程菌株产量为107 g/L，在保持95%的高转化率的条件下，生产效率可以达到4.5 g/L/h。此外，初次培养得到的工程菌株在二次利用时仍保持了73%的高效率。此外，作者在本研究中鉴定了几个影响系统效率的关键因素，如培养基条件、离子浓度等。整体来看，作者的研究内容不仅优化了从乙酰丙酸到4-HV的生产过程，也为未来规模化生产提供了可行的技术路径。
研究背景
随着化石燃料的大量使用及其资源的逐渐枯竭，相关环境污染问题日益严重。因此，多种利用环保和可再生资源的生物工艺被开发用于生产精细化学品和大宗化学品，以实现工业过程的可持续发展。在这一背景下，微生物细胞工厂作为一种多功能平台，已被广泛应用于生物基化学品的生产中。在可持续化学品的研究领域，4-HV不仅是生产具有优良物理及机械性能的生物可降解聚酯的重要单体，其衍生物γ-戊内酯还是合成液体运输燃料中的关键中间体。然而，传统化学合成途径在合成4-HV时存在一系列问题，例如产量低下和对严苛条件的依赖，这促使科学家探索替代的生产方法，例如全细胞生物催化或从LA（乙酰丙酸）作为底物进行酶催化等技术。
作者在前期研究中于大肠杆菌菌株中开发了一个无抗生素质粒系统，通过infA的表达回补，和LA诱导的HpdR/PhpdH调控3HBDH*（3-羟基丁酸脱氢酶突变体）和CbFDH（甲酸念珠菌脱氢酶）的表达，使得4-HV的产量达到了82 g/L、生产效率为3.4 g/L/h的，同时摩尔转化效率为92%，展示了无抗生素和无外加诱导剂下生产4-HV的可行性。尽管作者的无抗生素和无诱导剂系统在产量和生产力上分别比使用抗生素和IPTG诱导的生产策略18%和24%，这一差距表明优化微生物细胞工厂的复杂性，并表明需要进一步优化，以完全发挥无抗生素和无诱导剂实现4-HV高效生产的潜力。
科学发现
作者在本研究中通过采用eGFP作为报告基因，在实验中观察了不同浓度的LA（2至10 mM）对上游具有不同5′UTR（IRHF）及BCD2（IRBHF）的eGFP表达的影响。结果显示，与未添加LA的对照组相比，两种菌株在添加LA后荧光强度均有显著提升。而在eGFP前融合表达关键酶3HBDH*与CbFDH后，这些eGFP融合蛋白出现了一定程度的表达渗漏，其中IRBHF比IRHF显示出较高的表达渗漏（26%）。此外，作者发现IRBHF对诱导效果有明显的剂量依赖性，随着LA浓度增加，荧光强度逐渐增强并在8 mM达到高峰；相反，IRHF的荧光强度在所有浓度下保持恒定。作者认为这种表达增强效应可归因于BCD2本身的结构，这是一种标准化的UTR，在utr_designer的计算显示其具有更高的翻译效率（14%）。此外，BCD2通过其独特的双RBS配置，有效地优化了翻译过程。而且位于编码序列上游的5′UTR可以通过影响mRNA的稳定性及翻译效率进一步调节蛋白表达。基于这些发现，作者认为BCD2系统进行3HBDH*与CbFDH的表达显得尤为合适。
图一 不同5'UTRs对3HBDH*与CbFDH表达的影响
作者在摇瓶中使用全细胞生物转化策略用于4-HV的生产。通过过表达3HBDH，可以有效地催化LA转化为4-HV，并产生一个NAD+，同时再由CbFDH通过氧化甲酸为CO2来实现NADH的再生。随后，作者系统的表征了IRBV菌株（表达3HBDH和CbFDH，可由LA诱导）的生产能力，并与IRV750f（含有原生5' UTR的3HBDH*/CbFDH，可由LA诱导）和ILV（含LacI/PLlacO1系统的3HBDH*/CbFDH，可由IPTG诱导）进行比较。经过3小时的生物催化转化后，IRBV、IVL和IRV750f菌株显示了相似的4-HV产量，分别达到20.36 g/L、20.37 g/L和16.33 g/L，生产率分别为6.8 g/L/h、6.8 g/L/h和5.3 g/L/h。此外，IRBV的生产率比IRV750f高出28%，凸显了引入BCD2用于表达3HBDH和CbFDH的有效性。作者也进一步使用了SDS-PAGE验证了IRBV中3HBDH和CbFDH的稳定表达，确认其与与ILV的表现相当。因此，IRBV系统被作者选用在5 L级联发酵罐中进行放大生产4-HV。
图二 IRBV通过全细胞生物转化生产4-HV
作者进一步使用两阶段培养策略进行了IRBV菌株的发酵培养，同时明确区分了细胞生长期和产物生产期。作者认为细胞在接种后约12小时开始生长期，直到细胞的OD600值达到50后转入产物生产期，此时再添加LA和甲酸。作者在图三中展示了优化条件下4-HV生产过程中的关键参数如乳酸、甘油、甲酸和4-HV的浓度后细胞的生长情况。值得注意的是，IRBV表现出卓越的生产性能，在添加底物24小时后，4-HV的最大产量达到了107 g/L，产率为4.2 g/L/h，摩尔转化率达到95%。这些结果凸显了作者所开发工程生产菌株（BCD2_3HBDH_BCD2_CbFDH；LA诱导型）相比当前报告的最高产量的4-HV菌株的优越性。特别值得一提的是，作者设计的4-HV生产菌株无需添加抗生素和特定的诱导剂，这与过去依赖于氯霉素和卡那霉素的质粒系统以及IPTG诱导的PLlacO1系统表达3HBDH*/CbFDH的方法形成了鲜明对比。此外，IRBV比与使用天然5'UTR的IRV750f对表现出至少30%的4-HV产量提高以及24%的生产力提升，再次证实了引入BCD2系统在3HBDH*和CbFDH表达上的效率。
图三 5 L发酵罐中的4-HV发酵生产
尽管作者将生物转化过程延长至48小时并严格控制了LA的供应，4-HV的浓度仍未能超过107 g/L的阈值，同时还观察到了LA的积累。通过SDS-PAGE分析显示，关键蛋白3HBDH*和CbFDH在36小时的培养周期中表达增强，未发现因蛋白质错误折叠形成的包涵体，表明酶的可用性、浓度及溶解性不太可能是限制4-HV生产的因素。作者进一步研究对IRBV培养物进行二次实验中，发现重复使用的细胞在4-HV的产量上保持了至少73%的产率。此外，在36小时的连续批次培养中作者添加甲酸钠和LA以促进NADH的再生，增加了培养基的离子浓度。随着离子浓度的增加，4-HV的生产效率显著下降，尤其在离子浓度达到1.5M时减少了22%，作者认为可能是由于盐浓度直接影响了酶的活性或结构。此外，作者在实验中未能观察到进一步增加的4-HV产量，推测可能是由底物耗尽或产品积累引起的。这些结果提示，虽然连续提取或原位产品分离等策略可能有助于克服这些限制，但提高工业生产中4-HV的持续生产能力还需要进一步优化过程条件和酶表达系统。
图四 探索4-HV生产中的限制条件
总结展望
4-HV是一种可持续生产的关键化学中间体，广泛应用于多个工业领域。它不仅是生产生物可降解塑料、先进包装材料和纺织品的重要原料，而且还作为生物基燃料的前体物质具有极大的发展潜力。因此，4-HV在促进环保和支持可持续能源解决方案方面扮演着重要角色。作者在本研究使用全细胞生物催化技术，利用经过改造的IRBV菌株在生产4-HV方面的显著成就，使用LA作为出发底物可以生产4-HV，最高产量达107 g/L。此外，作者通过引入BCD2系统显著提高了4-HA合成关键酶3HBDH*和CbFDH的翻译效率，从而有效促进了从LA到4-HV的高效生产。值得注意的是，作者发现该生产菌株可以在多轮4-HV生物转化中重复使用。另外，作者在4-HV生产中观察到的产量继续提升的瓶颈并非由3HBDH*和CbFDH的浓度或溶解度引起。未来的研究应关注如何实现细胞高密度培养、降低培养基中的离子浓度、改造底物和产物的转运蛋白，以及提高3HBDH*的催化活性等方面，以进一步提升4-HV的生产潜力。
引用方式
Sathesh-Prabu, C., Tiwari, R. & Lee, S.K. Enhancing translation efficiency and exploring constraints in high-level 4-hydroxyvaleric acid production from levulinic acid in Escherichia coli. Syst Microbiol and Biomanuf (2024). https://doi.org/10.1007/s43393-024-00258-8
Systems Microbiology and Biomanufacturing(系统微生物学与生物制造（英文），简称SMAB，ISSN：2662-7655) 是由江南大学主办，Springer Nature出版集团出版的英文期刊。期刊SMAB致力于为工业微生物与生物制造过程领域的新发现、新方法和新技术提供报道的平台，由江南大学徐岩教授和印度毒理学研究所Ashok Pandey教授共同担任本刊主编，江南大学刘龙教授担任执行主编，编委分布于全球近20个国家，更多内容详见期刊主页。
2
编审周期：
目前，第一轮评审时间平均为22天，稿件录用后将及时在线发表。
SMAB诚邀系统微生物学与生物制造领域的研究人员踊跃投稿！投稿范围包括但不限于：工业微生物学与发酵工程、合成生物学与代谢工程、工业酶学与生物催化、食品组学与食品生物制造、系统生物学与发酵过程优化控制等。稿件类型包括研究论文(Research article)、综述(Review)和快讯(Short communication)。
期刊主页：
https://www.springer.com/journal/43393
投稿平台：https://www.editorialmanager.com/smab/default.aspx
