美国内布拉斯加大学Mark Wilkins团队
最新研究成果
Evaluation of brown midrib (bmr) sorghum stover as potential renewable biomass feedstock for poly(3-hydroxybutyrate) production employing Paraburkholderia Sacchari and Cupriavidus necator
高粱秸秆作为P(3HB)生产原料的研究
原文链接
https://doi.org/10.1007/s43393-024-00281-9
聚羟基烷酸酯（PHAs）作为一类具有极大应用前景的生物降解塑料，正日益受到人们的广泛关注，而同时高粱秸秆作为一种丰富且可再生的生物质资源，具有成为PHA生产原料的潜力。作者在本研究中评估了使用不同高粱秸秆来生产聚羟基烷酸酯（PHAs）的应用潜力，推测棕色中脉高粱（bmr）的各突变体会由于其独特的木质素含量组成。通过比较五种高粱秸秆样品（野生型及四种bmr突变体）作为聚(3-羟基丁酸酯)（P(3HB)）生产的底物，作者发现在碱预处理高粱秸秆水解液（SSH）中使用Paraburkholderia sacchari 代谢以生产P(3HB)时，基于bmr6的SSH生产P(3HB)的产量最高，达7.2 g/L，而基于野生型SSH则为仅有4.2 g/L。作者进一步使用Cupriavidus necator 在碱预处理液（APL）中合成P(3HB)，并采用氧化酶-介体-表面活性剂系统（OEMS）提高了APL中的P(3HB)生产。结果显示，使用OEMS系统的bmr2-APL相比未使用OEMS的相同APL进行发酵后，其PHB产量增加了28倍。这是首次发表利用高粱秸秆生产聚羟基烷酸酯（PHAs）的研究，同时也是首次报道基于糖类和木质素生产PHA的方法。
图一 使用高粱秸秆糖水解物发酵生产P(3HB)工艺示意图
研究背景
传统的石油基塑料因其优异性能而得到了广泛应用，但其由于降解困难带来了严重的环境污染问题。当前仅有少量塑料被回收或焚烧处理，而大部分仍在环境中累积。因此为缓解石油基塑料带来的环境污染问题，当前亟需开发与石油基塑料性能相当的可降解塑料。聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB))是一种有前景的可降解塑料，具有高生物相容性，并且可通过微生物发酵生产。然而，P(3HB)的大批量商业化生产受限于高昂的原料成本，占总生产成本的50%左右。为此，如何快速获得大量廉价原料用于P(3HB)的生产成为关键问题。木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中的纤维素和半纤维素可以转化为碳源进行P(3HB)生产，但其中木质素的处理仍是难题。高粱是一种适合用于生物转化的底物，尤其是其棕色中脉高粱bmr突变体，它的秸秆中的木质素含量较少，提高消化率。作者在本研究评估了野生型高粱及四种bmr突变体高粱品系的生物质组成及其作为P(3HB)生产原料的潜力。作者首先通过碱性预处理去除木质素，随后利用微生物P. sacchari和C. necator将预处理后的秸秆转化为P(3HB)。这项研究首次比较了不同高粱品系来源的秸秆在P(3HB)生产中的表现，并首次实现了利用粮食高粱秸秆生产P(3HB)。
科学发现
作者首先对原始高粱秸秆样品进行成分分析，对包括各类多糖（葡聚糖、木聚糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖）、总木质素、秸秆提取物（水溶性和酒精溶性提取物）及灰分含量进行了测定。结果如表一所示，野生型秸秆和叠加突变体秸秆的葡聚糖含量最高，分别为29.4%和31.2%，而突变体bmr2、bmr6和bmr12则较低。木聚糖含量仍然是野生型和叠加突变体最高，但野生型秸秆的半乳聚糖含量最低，叠加突变体秸秆的阿拉伯聚糖含量最低，而叠加突变体秸秆的甘露聚糖含量最高。整体来看，bmr2、bmr6和bmr12突变体的秸秆中碳水化合物含量比野生型秸秆低7%至12%。作者发现，在木质素含量方面也是野生型的含量较高（21.3%），而bmr2、bmr6、bmr12和叠加突变体秸秆中的含量则分别为18.4%、18.0%、17.1%和15.7%，与之前的研究一致，表明bmr突变体秸秆的木质素含量通常会减少10%至25%。这是由于bmr突变体在单木质素生物合成中存在缺陷，进而会导致木质素浓度和组成发生变化。水溶性提取物在所有样品中占总提取物的80%以上，其中包括非结构性糖、含氮物质和其他无机物质，而剩余的叶绿素和蜡质物质则存在于乙醇溶解物中。
表一 高粱秸秆原材料成分分析
由于在预处理过程中去除了大量的提取物和木质素，作者发现预处理后的各高粱秸秆样品中葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖的含量相比原始生物质有所增加（表二）。然而，不同高粱品系秸秆预处理后的生物质中碳水化合物含量增加的比例并不相同，这表明在预处理过程中不同品种的生物质成分损失不均。例如，预处理前，bmr2秸秆的总碳水化合物含量比野生型高粱秸秆低约16.6%，但预处理后比野生型高3.4%。除了野生型样品外，预处理后的高粱秸秆样品中的木质素含量都比未预处理的样品高。作者推测这可能是因为野生型高粱秸秆中的提取物含量最低。由于碱性预处理过程中去除了大部分提取物，而提取物含量较高的秸秆样品在预处理过程中溶解的生物质较多，所以尽管样品部分脱木质化，但预处理后高粱秸秆样品中的木质素含量仍有所增加。作者测试发现野生型秸秆的脱木质化率最高，为42%，其次是bmr2（36.7%）、叠加型突变体（36.5%）、bmr12（34.3%）和bmr6（29.7%）。
表二 预处理后高粱秸秆成分分析
作者随后也测试了不同高粱品系秸秆在碱预处理-酶解后的葡聚糖、木聚糖和总糖回收率。结果表明，野生型高粱秸秆的葡聚糖回收率（77.9%）显著低于其他品系（叠加突变体为92.1%，bmr2为96.0%，bmr6为95.0%，bmr12为92.4%）。然而，各样品间的木聚糖回收率差异不大。总体上，野生型高粱秸秆的总糖回收率最低，为75.3%，显著低于其他高粱秸秆品系的总糖回收率。
图二 碱预处理-酶解后高粱秸秆成分分析
作者认为选择合适的碳源在 P(3HB)的生物合成中至关重要。作者在本研究中首先尝试使用未经解毒处理的不同高粱秸秆水解物（SSHs）用于培养 Paraburkholderia sacchari，并检测其细胞生长和 P(3HB) 生产情况。结果显示，除野生型的SSH外，所有培养物在24小时内均检测到有P(3HB)的产生，而野生型的SSH 直到 48 小时才检测到P(3HB)的产生。在培养120 小时后，基于bmr6-SSH培养生产的P(3HB) 最终浓度为 7.2 g/L，显著高于其他培养物。而基于其他突变体来源的SSH生产得到的 P(3HB) 浓度彼此之间无显著差异，但均高于野生型SSH。120 小时后，野生型的SSH培养的细胞OD 值最低（17.3），而bmr6-SSH中的OD值最高（21.7）。作者进行计算并比较了基于各SSH样品生产的P(3HB) 收率，发现bmr6-SSH 和 bmr12-SSH突变体的收率较高最高，bmr2 突变体最低。
图三 摇瓶发酵中的P(3HB)浓度、P. sacchari 生长和糖消耗情况
作者发现在使用SSHs进行P(3HB)发酵过程中，还同时产生了木糖醇，其中bmr6-SSH的木糖醇产量最高，为2.3 g/L，bmr2-SSH最低，为0.98 g/L。作者推断是P. sacchari在高木糖条件下产生的木糖醇。
图四 基于各样品SSHs发酵生产木糖醇
随后作者比较了使用OEMS处理前后的APLs进行P(3HB)生产的情况，未使用OEMS时，基于野生型-APL和bmr6-APL进行培养获得的P(3HB)浓度最高，为0.12 g/L，而基于bmr2-APL进行培养获得的产量最低，为0.02 g/L。而加入OEMS后，在野生型-APL进行发酵获得的P(3HB)浓度达到1.2 g/L，是未使用OEMS的10倍。作者认为野生型-APL的高P(3HB)产量可能与其木质素的可利用性和结构有关，而bmr突变高粱木质素含量较低，组成也发生了改变，影响木质素向P(3HB)的转化。基于叠加突变体-APL生产获得的P(3HB)浓度为0.73 g/L，显著高于其他APLs。作者发现OEMS的出来显著提高了bmr2-APL的P(3HB)产量28倍，这表明bmr高粱木质素结构与OEMS的相互作用值得后续进一步研究。OEMS由漆酶、AAO、ABTS、Aerosil® R816和吐温80组成，但当前OEMS如何增强APLs向P(3HB)的转化尚不清楚。而移除OEMS中的AAO和漆酶后，作者发现P(3HB)生产分别下降约23%和65%。ABTS是漆酶分离低分子量木质素的重要基质；而Aerosil® R816由疏水性二氧化硅纳米颗粒组成，降低界面表面张力，增强微生物对底物的可用性；而吐温80则可以促进预处理生物质的酶解消化。
图五 OEMs处理对P(3HB)产量的影响
总结展望
高粱及其bmr突变体在生产聚（3-羟基丁酸酯）（P(3HB)）方面的潜力正在引起广泛关注。随着第二代生物质转化技术的发展，探索高粱秸秆作为P(3HB)生产原料的研究变得尤为重要。作者在本研究中首次揭示了利用野生型和bmr突变体高粱秸秆生产P(3HB）的潜力，并展示了从单一生物质中同时提取碳水化合物和木质素生产P(3HB）的创新工艺。作者发现，bmr的突变显著改变了生物质组成，进而提高了P(3HB）的产量。由于降低了木质素含量，突变体中的木质纤维素生物质向糖类和P(3HB）的转化效率大幅提升。在实验中作者发现，bmr6突变体、bmr12突变体或其叠加突变体的高粱秸秆在非解毒预处理水解液中展示了最高的P(3HB）生产性能。此外，作者进一步利用OEMS显著提升了bmr2突变体的P(3HB）产量，这一发现表明突变体中的愈创木基（G）或丁香基（S）木质素与OEMS系统可能存在协同作用，进一步促进了P(3HB）的合成。尽管尚需进一步优化生产工艺，这一突破性研究为高粱秸秆的高效利用开辟了新路径，并为木质纤维素生物转化生产高附加值产物提供了新的思路。
引用方式
Vallecilla Yepez, L., Li, M., Sattler, S.E. et al. Evaluation of brown midrib (bmr) sorghum stover as potential renewable biomass feedstock for poly(3-hydroxybutyrate) production employing Paraburkholderia Sacchari and Cupriavidus necator. Syst Microbiol and Biomanuf (2024). https://doi.org/10.1007/s43393-024-00281-9
Systems Microbiology and Biomanufacturing(系统微生物学与生物制造，简称SMAB，ISSN：2662-7655) 是由江南大学主办，Springer Nature出版集团出版的英文期刊。期刊SMAB致力于为工业微生物与生物制造过程领域的新发现、新方法和新技术提供报道的平台，由江南大学徐岩教授和Bioresource Technology期刊原主编Ashok Pandey教授担任本刊主编，编委分布于全球近20个国家，更多内容详见期刊主页。
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