江南大学王小元教授团队的最新研究成果
DNA scaffold assisted ectoine production in Escherichia coli
DNA支架辅助大肠杆菌四氢嘧啶生物合成
在SMAB正式上线
原文链接
https://link.springer.com/article/10.1007/s43393-023-00180-5
DNA 支架作为一种翻译后新策略被广泛应用于提高产物合成效率。在本研究中，作者采用DNA支架技术以协助大肠杆菌中四氢嘧啶的生产，成功在大肠杆菌细胞内实现多酶催化反应级联，显著提高了四氢嘧啶的生产效率与产量。
研究背景
四氢嘧啶作为一种高附加值产品，市场需求量极大。通过嗜盐菌大规模生产四氢嘧啶加速了设备腐蚀和下游加工的复杂性。目前虽然可以通过非嗜盐菌株生产四氢嘧啶，但在葡萄糖转化率和四氢嘧啶产量方面还有很大的进步空间。因此，寻找新的解决方案，以提高四氢嘧啶合成效率和产量迫在眉睫。
DNA支架系统作为优化目标产物异源合成的潜力工具，仅组装对目标产物合成有用的代谢途径，强制酶靠近并增加中间体的局部浓度，对提高产物合成效率大有帮助。作者利用该方法协助大肠杆菌中四氢嘧啶的合成，获得了意料之外的效果（图1）。
图一 作用于四氢嘧啶代谢途径的DNA支架示意图
科学发现
为了探究DNA支架上不同酶结合位点间距和酶结合方向对四氢嘧啶生产的影响，作者构建了质粒pFV5-pFV10（图 2）。根据发酵结果观察到，含有DNA支架结构的菌株的四氢嘧啶产量均不同程度的高于不含有DNA支架结构的对照菌株MWZ003/pFV4，这很好的直接证明了DNA支架的使用对四氢嘧啶的生产起到了一定的作用。同时，也观察到在相同的酶结合位点间距中，酶的反向结合效果均优于酶的正向结合。其中，拥有酶的反向结合且酶结合位点间距为11 bp的菌株MWZ003/pFV8拥有最高的四氢嘧啶产量，表明该条件最适合四氢嘧啶生产。与对照菌株MWZ003/pFV4相比，菌株MWZ003/pFV8的胞外四氢嘧啶产量提高了24.3%，达到了14.73 g·L-1。
图二 调整酶结合位点之间的间距和DNA支架上酶结合的方向
为了优化DNA支架单元的重复数，另外构建了n=1, 8, 12的质粒pFV15-17（Fig. 3）。根据发酵结果显示，n=4时的DNA支架上的酶结合位点足以容纳融合酶定位。与MWZ003/pFV8（n=4）相比，MWZ003/pFV16（n=8）和MWZ003/pFV17（n=12）的四氢嘧啶产量分别降低了5.9%和29.49%，这意味着四氢嘧啶的产量不是随着重复单元数的增加而增加。推测可能是由于支架的重复单元过多，导致大量酶结合位点冗余，支架上的融合酶结合位置分散且距离较远，使得酶促反应效率不增反降。
图三 调整DNA支架上的重复单元
为了探究增加了限速酶EctB的表达量后，再利用含有不同酶结合位点化学计量数的DNA支架是否会进一步提高体内四氢嘧啶的产量问题，在质粒pFV24的基础上，构建了7个包含不同酶结合位点化学计量数的DNA支架结构质粒pFV25-31（图 4）。其中，EctA:EctB:EctC酶结合位点之间的比例分别为1:1:1，1:2:1，2:1:1，1:1:2，2:2:1，1:2:2和2:1:2。整体观察菌株的葡萄糖消耗过程发现，在EctB-ZFb融合酶前添加了PR启动子后，所有菌株的葡萄糖消耗速率下降，除了菌株MWZ003/pFV27，因此，将发酵时间由36 h延长至48 h。观察四氢嘧啶产量发现，最高产菌株为酶结合位点比例为1:2:2的菌株MWZ003/pFV30（19.95 g·L-1）。实验结果证明，EctB和EctC酶对于四氢嘧啶的生产十分重要。菌株MWZ003/pFV27的四氢嘧啶产量最低，只有11.72 g·L-1，这可能是因为菌株将大量的底物用于生长，同时也表明在DNA支架上只增加EctA酶结合位点不利于四氢嘧啶的生产。因此，选择拥有最高四氢嘧啶产量的菌株MWZ003/pFV30为最终菌株。对最终菌株MWZ003/pFV30进行不同温度转换时间测验，最后得到菌株在发酵后4 h将温度由37 ℃上升到42 ℃时效果最好，胞内四氢嘧啶产量达到22.79 g·L-1，产物转化率为0.65 g·g-1葡萄糖。
图4 用增强的EctB-ZFb表达修饰DNA支架上酶结合位点的化学计量数
总结展望
DNA支架作为一种新策略被用于协助大肠杆菌 MWZ003 中四氢嘧啶的生产。作者详细探究了 DNA 支架的各种修饰对四氢嘧啶生物合成的影响。该研究为基于DNA支架的微生物发酵工艺提供了重要的实验验证，同时，该策略可应用于其他微生物生产工艺，进一步发展和完善微生物发酵产业。此外，还应考虑 DNA 支架的结构特征及其与目标产物合成途径的关系，以实现更高效的代谢工程设计。
引用方式
Liu, Z., Fang, Y., Li, H. et al. DNA scaffold assisted ectoine production in Escherichia coli. Syst Microbiol and Biomanuf (2023). https://doi.org/10.1007/s43393-023-00180-5
刘紫维，江南大学生物工程学院2020级硕士研究生，发酵工程专业。
王小元，江南大学生物工程学院/食品科学与技术国家重点实验室教授，长期从事微生物细胞膜和细胞壁组成、结构及功能研究。主持十三五课题、973课题、863项目、国家自然科学基金项目、江苏省基础研究计划创新学者攀登项目等。在PNAS等学术杂志上发表论文百余篇，出版英文专著3部。获全国工商联科技进步二等奖、中国侨界创新人才贡献奖和教育部科技进步二等奖，被授予“十一五”科技创新先进个人。入选教育部长江学者奖励计划特聘教授。任Subcellular Biochemistry国际顾问编委、Biotechnology and Applied Biochemistry副主编、Frontier in Microbiology副主编、Journal of Food Processing and Preservation及PLOS ONE编委。
Systems Microbiology and Biomanufacturing(系统微生物学与生物制造，简称SMAB，ISSN：2662-7655) 是由江南大学与Springer Nature出版集团合作主办的英文期刊。期刊SMAB致力于为工业微生物与生物制造过程领域的新发现、新方法和新技术提供报道的平台，江南大学副校长徐岩教授担任主编，Bioresource Technology期刊主编Ashok Pandey教授担任期刊首席顾问，更多内容详见期刊主页。
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