印度Pradeep K. Das Mohapatra团队
最新研究成果
16S amplicon sequencing of the gastrointestinal microbiota of Cirrhinus reba and isolation of an autochthonous probiotic using culture based approaches
16S扩增子测序揭秘Cirrhinus reba肠道微生物组成
原文链接
https://doi.org/10.1007/s43393-024-00285-5
鱼类肠道微生物组与宿主的健康息息相关。作者在本研究采用16S扩增子测序和传统培养方法相结合的策略对Cirrhinus reba肠道微生物群落进行了全面分析。作者发现，变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和梭杆菌门在Cirrhinus reba肠道中占主导地位，而在“属”水平上，假单胞菌属、芽胞杆菌属、沙雷菌属、乳杆菌属和气单胞菌属等细菌最为丰富。值得注意的是，革兰氏阴性病原菌如假单胞菌属、沙雷菌属和气单胞菌属在Cirrhinus reba肠道中含量较高，作者推测这可能与水体污染有关。随后，作者从Cirrhinus reba肠道中分离到一株对四种常见鱼类病原体表现出显著的拮抗作用的细菌PKS9A，并鉴定其为副球芽胞杆菌(Bacillus paramycoides)。随后，作者实验对菌株的益生进行了生理分析及安全性评估，发现其不仅能分泌多种胞外消化酶辅助鱼类代谢，也腹腔注射实验中明确了其足够安全。作者在这项研究中不仅揭示了Cirrhinus reba肠道微生物群落的组成特征，还发现了对该鱼类的养殖有益的自生益生菌，这将有助于改善Cirrhinus reba的营养健康水平。
研究背景
鱼类肠道中存在着多样化的微生物群落,包括细菌、古菌、病毒和真菌。这些微生物对宿主的代谢功能具有重要影响，涉及营养消化、能量获取、病原体防御和免疫增强等方面。近年来，随着不依赖培养方法如定量实时PCR、指纹图谱技术和荧光原位杂交技术等的发展，人们对鱼类肠道微生物群落的认识有了显著提高。特别是宏基因组学方法的广泛应用，不仅可以快速方便的阐明群落组成，还能揭示复杂环境样本中微生物组的功能特征，有助于建立宿主、肠道微生物和周围生态系统之间的联系。Cirrhinus reba作为印度人民喜闻乐见的食用鱼类，目前面临着人类过度捕捞、生态气候恶化、自然栖息地不断丧失和病原体疾病泛滥等威胁，其种群数量也在逐年下降。作者认为研究Cirrhinus reba中的肠道微生物组可以用于改善其生长和健康状况，其中挖掘出的自生益生菌或能替代抗生素或化学药物对鱼群健康进行保护。因此，作者旨在通过16S扩增子测序和传统培养方法相结合的方式，全面分析了Cirrhinus reba肠道微生物组，并分离了其自生益生菌PKS9A，为该濒危物种的保护和可持续养殖提供科学依据。
图一 采样区域的地理空间分析
科学发现
作者首先通过16S扩增子测序分析了Cirrhinus reba肠道微生物群落的组成。作者发现，Cirrhinus reba肠道中主导的微生物主要属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和梭杆菌门。这一发现与其他鱼类如亚洲鲈鱼和草鱼的研究结果相似，表明由这些细菌门类占据主导可能是鱼类肠道微生物组的共同特征。当细分这些微生物到属水平上时，假单胞菌属、未分类芽胞杆菌科、芽胞杆菌属、沙雷菌属、乳杆菌属、未分类芽胞杆菌目、气单胞菌属、甲烷钙单胞菌属、未分类肠杆菌科和未分类梭菌目则是其中最丰富的十个属。其中，作者发现革兰氏阴性病原菌如假单胞菌属、沙雷菌属和气单胞菌属在肠道中含量较高，这可能与水体污染有关（图一）。
图一 各优势菌群的丰度
此外，作者在研究还发现Cirrhinus reba肠道微生物群落具有较高的α多样性，这与底栖摄食鱼类的特征相符。
图二 Cirrhinus reba肠道微生物群的Chao 1估算值与香农指数
在对Cirrhinus reba肠道微生物进行培养实验中，作者一共分离到了24种可培养的细菌，其中一株命名为PKS9A的菌株对所有受测病原体都有拮抗作用，比如常见鱼类病原体如副溶血弧菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌均有抑制作用（图三）。
图三 PKS9A菌株对病原体的拮抗效果
随后作者对PKS9A的菌落形态、孢子形成能力进行了研究（表一），并利用扫描电子显微镜镜检发现其也具有二裂殖杆菌的性质。
表一 各优势菌群的丰度
随后，作者通过进一步的生化测试发现，分离出的PKS9A菌株具有胆盐水解酶活性、良好的细胞表面疏水性和自由基清除能力。此外，PKS9A菌株还表现出产生多种胞外酶的能力，包括蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶和植酸酶等。作者推测这些酶的分泌对提高鱼类的消化能力和营养吸收具有重要意义。比如，该菌株产生的植酸酶可以帮助降解植物性饲料中的植酸，减少其对鱼类的生长抑制（表二）。
表二 PKS9A分离菌株的各酶活测定
作者进一步对PKS9A菌株进行安全性评估，以评价其作为益生菌的潜力，分析实验结果发现该菌株对常用抗生素都很敏感，同时也不具有溶血活性。随后，作者通过体内生物安全性实验进一步证实了PKS9A的安全性，该菌株的腹腔注射并不会引起鱼类的病理反应或死亡，肝功能指标也未发生显著变化。这些结果表明PKS9A菌株作为潜在的益生菌是安全的。
表三 PKS9A菌株腹腔注射实验的安全性评估
最后，作者通过16S rDNA测序和系统发育分析，鉴定出PKS9A菌株为副球芽胞杆菌(Bacillus paramycoides)。这是首次报道该菌种在鱼类中的存在，为水产养殖中益生菌的应用提供了新的选择。
图四 基于16S rDNA测序的PKS9A菌株系统进化树
总结展望
作者在本研究中通过16S扩增子测序和传统培养方法相结合的策略，全面分析了Cirrhinus reba肠道微生物群落的组成特征，并成功分离和鉴定了一株具有潜在益生作用的自生菌株。作者发现，Cirrhinus reba肠道微生物群落以变形菌门、厚壁菌门等为主导，但同时也存在较高比例的革兰氏阴性潜在病原菌，而这可能与水体污染有关，需要进一步研究水质参数与鱼类肠道微生物组成的关系。作者从Cirrhinus reba肠道分离得到的B. paramycoides PKS9A株表现出良好的益生特性，包括对病原菌的拮抗作用、产生多种胞外消化酶的能力以及良好的生物安全性等，未来将为的Cirrhinus reba人工养殖提供了安全的益生菌佐剂，对于提高Cirrhinus reba的营养状况和健康水平，保护这一濒危物种具有重要意义。然而，作者同时也指出，在将PKS9A株商业化应用之前还需要进行长期的生理试验评估。总的来说，作者在该研究中不仅为理解Cirrhinus reba肠道微生物生态提供了新的见解，也为该濒危鱼类的保护和可持续养殖提供了科学依据和实用策略。
引用方式
Systems Microbiology and Biomanufacturing(系统微生物学与生物制造，简称SMAB，ISSN：2662-7655) 是由江南大学主办，Springer Nature出版集团出版的英文期刊。期刊SMAB致力于为工业微生物与生物制造过程领域的新发现、新方法和新技术提供报道的平台，由江南大学徐岩教授担任本刊主编，江南大学徐岩教授担任本刊主编，编委分布于全球近20个国家，更多内容详见期刊主页。
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