江南大学刘龙教授团队的最新研究成果
Engineered Saccharomyces cerevisiae for de novo δ-tocotrienol biosynthesis
代谢工程改造酿酒酵母从头合成δ-生育三烯酚
在SMAB正式上线
原文链接
https://link.springer.com/article/10.1007/s43393-023-00167-2
δ-生育三烯酚作为维生素E的重要组分，因具有显著的抗炎和抗癌效果受到广泛关注。构建微生物细胞工厂进行δ-生育三烯酚的生物合成具有原料可再生、生长周期短、绿色环保等优势，是一种极具吸引力的替代性生产方式。本研究通过模块化工程策略在酿酒酵母中构建了δ-生育三烯酚的从头合成途径，并采用多种代谢工程策略进一步提高了工程菌株的生产性能。此研究为实现δ-生育三烯酚高效生物合成提供了可能，也为其它特定形式天然维生素E的生物合成提供了新思路。
研究背景
维生素E是生育酚和生育三烯酚的总称，包括α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-生育三烯酚这8种化合物，作为最主要的抗氧化剂之一，是维持机体代谢的必需维生素，功效广泛，市场需求量日益增长。除了具有抗氧化作用，生育三烯酚还具有一些生育酚所没有的功能，如降低胆固醇、神经保护、抗骨质疏松等特性。在生育三烯酚的四个异构体中，δ-生育三烯酚因具有对人类健康更丰富的生物活性，特别是抗炎和抗癌活性而备受关注。目前市场中的生育三烯酚类产品主要依赖于植物提取。植物提取法面临植物资源的有限性、生长周期较长、成本过高等问题，并且植物中δ-生育三烯酚的含量普遍较低，限制了δ-生育三烯酚的规模化生产。因此利用代谢工程技术构建微生物细胞工厂实现δ-生育三烯酚的生物合成是一种更持续、经济的方式，具有重要的研究意义。
科学发现
基于合成生物学中的代谢网络模块化方法，本研究将δ-生育三烯酚合成途径分为3个模块，包括甲羟戊酸合成模块、莽草酸合成模块和δ-生育三烯酚合成模块。首先，确定了拟南芥来源的对羟基苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）、集胞藻来源的尿黑酸牻牛儿基牻牛儿基转移酶（HGGT）和拟南芥来源的生育三烯酚环化酶（TC）均可在酿酒酵母中正常表达，且HPPD游离于细胞质中，HGGT定位于内质网，TC定位于脂滴。之后，通过引入δ-生育三烯酚合成模块，初步构建了可从头合成δ-生育三烯酚的底盘细胞，在含有酪氨酸的培养基中进行发酵时δ-生育三烯酚产量为18.1 μg/L。最后，通过引入红豆杉来源的GGPP合成酶（CrtE）和家鸡来源的FPP合成酶突变体FPSF112A对甲羟戊酸模块进行强化，δ-生育三烯酚产量提高至117.9 μg/L。
图一 δ-生育三烯酚从头合成底盘细胞的构建
通过过表达HPPD、HGGT和TC，发现HPPD的代谢产物HGA大量积累，说明HGA到δ-生育三烯酚之间存在限速环节，加强HGGT的表达可以提高其代谢产物MGGBQ的产量，但加强TC的表达不能促进MGGBQ向δ-生育三烯酚的转化。因此，尝试对拟南芥来源的TC进行信号肽预测和切除以解除该限速步骤，发现当信号肽切除长度为47aa时（命名为tTC），可以有效提高TC的催化活性，δ-生育三烯酚产量提高至283.9 μg/L。进一步通过直接融合、无支架组装和人工合成支架策略尝试对δ-生育三烯酚合成模块中的关键酶进行组装，加快中间产物的运输，以提高δ-生育三烯酚合成效率。结果显示，将HGGT和tTC通过短蛋白连接体进行融合表达，可有效提高δ-生育三烯酚的产量。在此基础上，通过蛋白支架SH3将HPPD与融合后的HGGT-tTC复合体进行模块化组装，δ-生育三烯酚产量提高至760.4 μg/L，是对照菌株的2.56倍。
图二 构建底物通道对δ-生育三烯酚合成的影响
为了进一步提高δ-生育三烯酚产量，通过组合策略优化δ-生育三烯酚合成。首先，通过“推-拉-阻”策略对莽草酸合成模块进行强化，以提高HGA的供给并解除δ-生育三烯酚合成对于酪氨酸添加的依赖，将所得最佳优化策略运用到δ-生育三烯酚高产菌株中，在不添加酪氨酸的情况下，δ-生育三烯酚产量达到796.1 μg/L。然后，通过Rosetta Cartesian_ddG预测改造靶点对tTC进行蛋白改造，其中突变体tTCN331P的活性较突变前有显著提高，δ-生育三烯酚产量提高到1455.5 μg/L。最后，通过过表达转运蛋白PDR11实现了δ-生育三烯酚的胞外分泌生产，对双相萃取发酵条件进行优化后，δ-生育三烯酚产量最终达到3262.2 μg/L。
图三 莽草酸和δ-生育三烯酚合成模块中的组合优化策略
总结展望
为了在酿酒酵母中实现δ-生育三烯酚的高效从头合成，通过引入δ-生育三烯酚合成模块，并强化甲氧戊酸合成模块中GGPP的供应，初步构建了从头合成δ-生育三烯酚的工程菌株。在鉴定并解除限速步骤后，组装HPPD、HGGT和tTC构建底物通道，并通过组合策略进一步提高δ-生育三烯酚的产量，为酿酒酵母从头合成δ-生育三烯酚提供了新思路。最终在双相萃取发酵条件下，δ-生育三烯酚的产量达3262.2 μg/L，为工业生产天然维生素E单体提供了一定的基础。
引用方式
Han, L., Wu, Y., Xu, Y. et al. Engineered Saccharomyces cerevisiae for de novo δ-tocotrienol biosynthesis. Syst Microbiol and Biomanuf (2023). https://doi.org/10.1007/s43393-023-00167-2
韩璐瑶，江南大学生物工程学院2020级硕士研究生，发酵工程专业。
刘龙，教授，国家优青、教育部重大人才工程(青年)入选者，现任江南大学生物工程学院院长。主要从事合成生物学与食品生物制造的基础理论、关键技术与工程应用研究。以通讯作者在Nature Chemical Biology、Nucleic Acids Research、Nature Communications等期刊发表论文200余篇，主编出版6部中英文著作和教材，获授权发明专利90件（其中国际授权发明专利15件）。以第一完成人获江苏省科学技术奖一等奖、全国商业科技进步奖特等奖、青山科技奖、闵恩泽能源化工奖杰出贡献奖等多项省部级科技奖励。
Systems Microbiology and Biomanufacturing(系统微生物学与生物制造，简称SMAB，ISSN：2662-7655) 是由江南大学与Springer Nature出版集团合作主办的英文期刊。期刊SMAB致力于为工业微生物与生物制造过程领域的新发现、新方法和新技术提供报道的平台，江南大学副校长徐岩教授担任主编，Bioresource Technology期刊主编Ashok Pandey教授担任期刊首席顾问，更多内容详见期刊主页。
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