Achieving high titer and yield in the bioconversion of L-threonine to 2-hydroxybutyric acid with Escherichia coli BL21

大肠杆菌高效转化L-苏氨酸生产2-羟基丁酸

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https://doi.org/10.1007/s43393-023-00224-w

      2-羟基丁酸（2-HBA）因其在药物研发、生物可降解聚合物生产及作为胰岛素抵抗早期检测的生物标记物等多方面的应用而受到关注，（2R）-4-氨基-2-羟基丁酸基团也因具有抗菌活性而备受瞩目，而（S）-2-羟基丁酸在合成治疗代谢综合征症状的PPARα激动剂中也有应用。此外，2-HBA还被报道可减轻过量摄入乙酰氨基酚引起的肝损伤，并可以添加到通过共聚合法合成的生物可降解聚合物中，以提高其相关材料特性。

      在本研究中，作者聚焦于通过使用重组大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)来提高从苏氨酸生产2-羟基丁酸（2-HBA）的效率。该过程涉及两步全细胞生物转化，包括使用大肠杆菌过表达苏氨酸脱水酶和酮还原酶。为了解决酮还原酶反应中NADH再生的速率限制步骤，作者使用T7启动子过表达了源自Candida boidinii的甲酸脱氢酶，最终产量高达1015 mM，产率达0.70 mol/mol。进一步的研究显示，通过敲低三种负责中间产物（2-酮丁酸，2-KBA）降解的酶——丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）、丙酮酸氧化酶（PoxB）和丙酮酸脱氢酶复合体（PDHc），可以将产率提高到接近理论最大值1.00 mol/mol的0.99 mol/mol。此外，作者通过构建多步阻断中间代谢产物代谢的突变体，将产量提升至1400 mM，生产效率达58 mmol/L/h，是目前为止报道的最高的2-HBA产量和产率。

      总的来说，这项研究通过遗传工程手段显著提高了2-HBA的生产效率和产量，其中包括过表达特定酶和阻断与中间代谢产物2-KBA降解相关的代谢途径。这些改进不仅提高了2-HBA的产量，也为微生物代谢工程提供了重要的方法论指导，展示了通过精准的代谢调控来提高目标化合物产量的巨大潜力。

      2-羟基苯甲酸（2-HBA）是一种自然存在的有机化合物，也可以通过化学合成得到。它是苯甲酸的衍生物，其分子结构包含一个苯环、一个羟基和一个羧基。最初是从植物提取物中发现的。

      2-HBA主要用作合成其他化学物质的中间体，如染料、香料、医药等。它还用作食品和化妆品的防腐剂。此外，2-HBA也被用于制造某些塑料和树脂，以及在环境科学中研究土壤和水体污染。

      针对2-HBA的广泛应用，目前已开发出多种生产方法。近期，从L-苏氨酸（一种商业上可获得且成本较低的必需氨基酸）作为底物出发的生物转化也被研究。其中一项研究中，过表达了同源苏氨酸脱水酶将L-苏氨酸转化为2-酮丁酸以及来自Alcaligenes eutrophus H16的乳酸脱氢酶将2-KBA还原为2-HBA，过程中需依赖NADH。同时，引入了Candida boidinii的甲酸脱氢酶来再生NADH，并利用外部供应的甲酸。目前在2-HBA生物合成中实现的最高产量为1240 mM，产率高达93%。

      本研究旨在开发一种更高效的微生物合成系统，用于2-HBA的生产。研究通过解耦所有活跃的竞争途径，构建一个无中间代谢产物降解的系统，并平衡每个反应步骤中酶的活性，避免中间代谢产物的过量积累。采用此策略，研究目标是在不影响生产速率的情况下，显著提高2-HBA生产的产量和产率。

 图一 2-HBA的代谢途径

      作者在先前的研究中改造大肠杆菌W3110菌株构建2-HBA生产菌株HB6，其能够在33小时内生产650 mM的2-HBA，时空产率达到19.7 mmol/L/h，转化率达0.95 mol/mol。为了避免底物提前耗尽，作者将苏氨酸和甲酸的初始浓度从700 mM提升至1600 mM。然而，无论是产量还是时空转化率均未观察到显著变化，这表明苏氨酸的底物浓度并非产量提高的限制性因素（如图二所示）。作者推测，影响NADH再生的Cb^FDH活性低下可能是限制反应速率的主要因素，因此作者寻找一个Cb^FDH活性更高的宿主。

 图二 高初始浓度条件下Thr转化为2-HBA的影响

      由于大肠杆菌BL21(DE3)具有其高蛋白表达能力，作者选择其作为替代宿主，并转化了与HB6菌株相同的生产质粒。与HB6菌株相比，BL21（DE3）菌株展现出更优异的转化性能，24小时内的产量达到823 mM，时空转化率为34.30 mmol/L/h。虽然其产率仅为0.65 mol/mol，且中间代谢物2-KBA积累量高，但作者依然认为BL21（DE3）是一个有潜力的宿主。

      此外，作者还研究了重组BL21（DE3）菌株对温度的依赖性，分别在30°C、35°C和40°C下进行了实验。在35°C和40°C下观察到了几乎一致的代谢物轮廓，表现为快速的苏氨酸利用，但甲酸和2-KBA的消耗不足，导致2-HBA产量低。特别是在这些温度下，即使存在足够的甲酸，12小时后2-KBA仍然大量未转化为2-HBA。这一观察表明FDH在35°C以上的温度不稳定，从而导致NADH再生能力受损。因此，作者选择了30°C作为后续在大肠杆菌BL21（DE3）中的研究的最佳温度。

      此外，作者推断是NADH再生速率限制了2-HBA的合成速率，于是构建了一个新的重组质粒pFT7，用于在T7启动子下高表达Cb^fdhA10C。这个质粒的复制子是pBR322（拷贝数约20），替代了原先在trc启动子下过表达Cb^fdhA10C的pFTrc质粒，后者复制子是p15A（拷贝数约10）。

      使用新的pFT7质粒后，作者利用SDS-PAGE分析显示，与pFTrc质粒相比，FDH蛋白含量显著提高。此外，同时粗细胞提取物中的FDH活性提升了大约十倍。新重组菌的2-HBA产量达到1015 mM，在24小时的培养后，转化率（0.70 mol/mol）和生产力（42.30 mmol/L/h）均有显著提高，并伴随着2-KBA积累的显著减少（图三）。这符合作者的假设，即有限的NADH可用性是导致2-HBA合成产量和速率低下的原因。同时，作者发现新构建菌株的2-KBA的显著积累可能影响了系统的效率，因为它对Ae^ldh有抑制作用。此外，为了提高转化率（0.7 mol/mol），作者需要进一步研究苏氨酸、2-KBA和2-HBA等代谢物的降解情况。

图三 高表达Cb^fdhA10C对Thr转化为2-HBA的影响

     低2-HBA产量（0.7 mol/mol）表明涉及的代谢物——苏氨酸、2-KBA和/或2-HBA——可能存在降解途径。为全面了解这一降解过程，作者在无细胞和含细胞的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）中孵育了每种代谢物。实验结果显示，在没有大肠杆菌BL21(DE3)的情况下，所有代谢物在整个孵育期间保持不变，没有发生降解。然而，在含细胞的情况下，中间代谢物2-KBA（而非苏氨酸和2-HBA）表现出快速降解。这些结果暗示，低产量的主要原因是存在降解2-KBA的酶（如图四所示）。

图四 E. coli中对代谢产物降解的影响

      作者根据之前对大肠杆菌W3110的研究，分析出丙酮酸降解酶，如丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）、丙酮酸氧化酶（PoxB）和丙酮酸脱氢酶复合体（PDHc）是2-KBA降解的主要因素。作者从野生型BL21(DE3)（称为BL-0）中依次敲除这些酶的编码基因，得到了三种突变菌株：BL-1（ΔpoxB）、BL-2（ΔpoxBΔpflB）和BL-3（ΔpoxBΔpflBΔaceE）。aceE基因编码丙酮酸脱氢酶（E1），aceF编码二硫辛酰转移酶（E2）和lpd编码硫辛酸脱氢酶（E3）。如图五所示，这些基因的敲除逐步减少了2-KBA的降解。与BL-0相比，poxB的删除减少了20%的降解，而pflB和poxB的双重删除减少了50%的2-KBA降解。最终，三重敲除（BL-3）完全阻断了2-KBA的降解。

图五 2-KBA代谢途径在基因敲除菌中被抑制

      作者继续评估了三重敲除菌株BL-3的性能，包括在两种不同苏氨酸浓度（30 mM和100 mM）条件下的2-KBA降解情况。在这两种情况中，大肠杆菌在12小时内几乎能够获得理论最大的2-HBA产量，分别为29.57 mM和99.47 mM，表明突变菌株成功地将苏氨酸转化为2-HBA，且没有2-KBA降解。此外，2-HBA在甲酸上的产量接近1.0 mol/mol，这意味着通过甲酸氧化再生的NADH被完全用于2-KBA到2-HBA的还原转化。

      随后作者使用高浓度的苏氨酸（1600 mM）和细胞（OD₆₀₀=168），以及高浓度的甲酸（1600 mM），进行了BL-3的高水平2-HBA生产实验（图六）。在相同条件下，也进行了BL-1和BL-2的实验，并与BL-3进行了比较。BL-3在24小时后产生了1400 mM的2-HBA，产量为99%。相比之下，BL-1和BL-2的产量分别为1097 mM、0.76 mol/mol和1250 mM、0.85 mol/mol。在所有三种情况下均形成了2-KBA中间体，但在BL-3中消失得比BL-1或BL-2更快。同时注意到甲酸的消耗量与2-HBA的产量等摩尔，表明它被完全用于由Ae^LDH催化的2-KBA到2-HBA的还原。

图六 利用2-KBA降解阻遏突变体生产2-HBA

      最后作者在表一中总结了以上讨论的每种突变体的产量、产率和生产力，而BL-3在产量、产率和生产力方面的结果是目前最好的。作者在本研究中开发的菌株和策略有助于实现苏氨酸到2-HBA的大规模生物转化。

      到目前为止，作者研究了苏氨酸到2-HBA的细胞内转化，着重于阻断2-KBA的降解途径（提高产量的关键步骤）和加速NADH再生（速率限制步骤）。为了进一步提高2-HBA产量，作者认为优化苏氨酸、2-KBA、2-HBA和甲酸的转运至关重要。已经有报道鉴定了一些与苏氨酸转运有关的膜蛋白，如tdcABC、yifK和rhtA编码的蛋白。此外，FocA，一种类水通道，已知负责甲酸转运。以上蛋白质以及与2-KBA和2-HBA转运有关的其他蛋白质，应该可能协同地进行优化。

表一 本研究中菌株生物转化生产2-HBA的差异总结

      作者成功建立了一种高效的大肠杆菌BL21(DE3)突变菌株，用于实现从苏氨酸到2-HBA的生物转化。通过在大肠杆菌BL21（DE3）中使用T7启动子下过表达NAD+依赖的甲酸脱氢酶（Cb^fdhA10C），并敲除基因组上三个负责2-KBA（反应中间体）降解的基因，构建了一株高效生产转化生产2-HBA的菌株（产量达1400 mM、转化率为0.99 mol/mol和时空转化率为58 mmol/L/h）。最后，作者认为进一步提高2-HBA生产经济性的另一个关键方面是使用葡萄糖作为底物而非苏氨酸。为此，将从苏氨酸到2-HBA的生物转化途径引入苏氨酸生产菌，并将苏氨酸合成途径扩展到2-HBA是未来可行的策略。然而，在单个微生物中结合这些途径存在多种挑战，例如需要平衡从葡萄糖到苏氨酸的生产速率与其转化为2-HBA的速率，以避免苏氨酸或其他代谢物的积累，这将是一项艰巨的任务。

Le, T., Bassey, B.F., Nguyen-Vo, T.P. et al. Achieving high titer and yield in the bioconversion of L-threonine to 2-hydroxybutyric acid with Escherichia coli BL21. Syst Microbiol and Biomanuf (2023). https://doi.org/10.1007/s43393-023-00224-w