响应面法-人工神经网络优化脂肪酶生产——系统微生物学与生物制造文章推荐

印度阿米蒂大学 Gurumurthy团队协同印度KLE 科技大学 Hombalimath团队最新研究成果

Response surface methodology (RSM) and artificial neural network (ANN) integrated optimization for lipase production by Bacillus holotolerans

响应面法-人工神经网络组合优化全耐受芽孢杆菌产脂肪酶

原文链接

https://doi.org/10.1007/s43393-023-00220-0

      响应面法(RSM)和人工神经网络(ANN)被认为是设计和开发各种生物衍生药的最有效的优化和建模研究方法。本研究主要聚焦于运用响应面法（Response Surface Methodology, RSM）和人工神经网络（Artificial Neural Network, ANN）技术，对基于Bacillus holotolerans生产脂肪酶的培养基参数进行建模和优化。

      作者首先通过单因子-一次（One-Factor-At-A-Time, OFAT）分析，确定了三酰基甘油对脂肪酶活性的显著影响。接着，运用Placket-Burman设计（PBD）筛选最优的碳源、氮源和诱导剂。之后，采用Box-Behnken设计（BBD）进一步确定了这些变量的最佳水平。

      研究结果表明，在最佳条件下（2.5%的糖蜜、2%的蛋白胨和0.1% CaCO₃、0.1% (NH₄)₂SO₄、0.1% MgSO₄.7H₂O），脂肪酶的产率达到了26.04 IU/ml。值得注意的是，虽然RSM和ANN两种模型都提供了准确的预测，但在数据拟合和估计能力方面，ANN表现出了比RSM更优越的性能。这一发现不仅展示了ANN在复杂生物工程优化过程中的有效性，也为未来类似药物的开发提供了重要的技术参考。通过这种方法，可以更精确地调控和优化生物制药过程中的关键参数，提高产品质量和产量，为生物技术领域带来更广泛的应用前景。

      在当前的生物化工研究领域，生物燃料、医疗保健和可持续发展等议题日益受到关注。特别值得一提的是，生物数据与前沿技术的融合，例如人工神经网络和深度学习，正引领着这一领域研究方法的革新。相较于传统研究手段，这种创新的结合模式在提高工业操作的经济效率、实用性和适应性方面展现了显著优势。

      脂肪酶作为一种关键的生物催化剂，在其生产过程中变量的优化对于提升酶产量至关重要。通过采用ANN方法，能够更加灵活地处理优化过程中的复杂数据集。此外，本研究中还创新性地将响应面方法（RSM）与ANN相结合，这一策略相比传统手段而言，提供了更多的优势。RSM作为一种基于经验的统计工具，能够在处理响应与一个或多个独立变量之间的关系时，为复杂系统的模型优化提供了有效的平台。

      作者以脂肪酶发酵生产为研究对象，重点分析了一个包含20个脂肪酶生产实验参数的数据集。在这些实验中，脂肪酶的产量作为输出指标，而输入变量包括糖蜜、蛋白胨和KH₂PO₄含量等关键的发酵研究参数。通过这些实验，作者展示了RSM与ANN整合应用在成本效益和适应性策略方面的优势，从而加深了人们对于脂肪酶生产优化过程中数据集处理能力的理解。

      在本研究中，作者首先采用单因素实验法（OFAT）对脂肪酶的产生效果进行了深入研究。结果如图一所示，在35℃、pH 7和150 rpm的条件下持续72小时培养可以得到最优的脂肪酶的产量。此外，作者详细展示了OFAT在优化VSH09脂肪酶生产过程中的各项参数。此外，根据先前的研究报告，不同组成的三酰甘油脂肪酸的油类在其水解过程中，可能会作为脂肪酶生产的诱导因素。

      此研究的核心在于利用单因素实验法精确控制实验条件，从而达到脂肪酶产量的最优化。通过严格控制温度、时间、pH值以及搅拌速度，作者不仅提高了实验结果的准确性和重复性，而且为未来相关领域的研究提供了宝贵的参考信息。研究中提到的不同成分油类对脂肪酶生产的潜在影响，也为后续的实验设计和脂肪酶应用开辟了新的研究方向。

 图一 脂肪酶活性与培养基成分的相关分析

      作者旨在通过一系列实验筛选对脂肪酶活性具有显著影响的碳源、氮源和矿物源，并进一步通过响应面方法（Response Surface Methodology, RSM）对培养基组分进行统计优化，以提高脂肪酶的产量和活性。

      首先，研究了12种不同配置的实验（如表一所示），以确定对脂肪酶酶活性有显著影响的碳源。实验结果表明，葡萄糖、糖蜜和果糖是影响脂肪酶活性的关键变量，其中葡萄糖的脂肪酶活性最高，达到22.62 IU/ml。此外，实验还显示，淀粉对脂肪酶活性的影响不显著。通过回归分析，作者发现这些因素与脂肪酶活性之间存在着强烈的线性关系，R2值高达98.09%，意味着这些因素与脂肪酶活性变化相关性很高。

      在氮源和矿物源的筛选中，作者通过Plackett-Burman（PB）实验测试了酵母提取物、肽膏、大豆肽膏等常用的氮源，而在矿物源方面，硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙和磷酸二氢铵等对脂肪酶活性具有显著影响。这些因素的R2值分别为99.14%和99.99%，表明了它们与脂肪酶活性之间的强线性关系。

表一 培养基成分 RSM 二次模型的方差分析

      作者进一步利用RSM方法优化了培养基成分，采用Box-Behnken设计来确定最佳的脂肪酶活性条件。实验发现，使用2.5%的糖蜜、1.4%的肽膏和1.1%的磷酸二氢钾作为培养基补充剂，在实验中显著提高了脂肪酶活性。方差分析（ANOVA）表明，这些交互项对脂肪酶产生的影响不显著。模型的R2值为97.93%，表明模型可以解释97.93%的响应变异性，而模型方程的皮尔逊系数（Pearson coefficient）为0.9521（95.21%），表明预测值与实验结果之间存在强相关性。

表二 比较将脂肪酶的观测值与模型预测值

      此外，作者采用了人工神经网络（ANN）分析方法来探索发酵工程中的复杂数据处理和优化问题。实验使用了多层感知器（MLP）作为主要的神经网络结构，并通过增量反向传播算法进行训练。在这一架构中，MLP的输出层转换函数被设定为线性形式，而隐藏层神经元采用了双曲正切函数（TanH）。在输入层，糖蜜（X1）、磷酸二氢钾（KH₂PO₄，X2）和蛋白胨（X3）分别作为碳源、氮源和矿物质源。网络输出的是菌株VSH 09产生的脂肪酶活性。

      为了寻找最优的神经网络架构，作者对多种具有不同隐藏层数量和转换函数类型的ANN拓扑结构进行了深入探讨（如表三所示）。模型的重要性通过确定系数（R2）和显著性指数（SI）进行评估。人工神经网络以其在信息处理方面的卓越能力而备受瞩目，其主要特点包括非线性操作、高度并行处理、对错误和噪声的适应性，以及良好的学习和泛化能力。与传统建模工具相比，ANN提供了一种模型独立的、灵活的并行处理方式，能够在错误和故障面前显示出较强的韧性。此外，ANN在处理不精确和模糊数据方面的学习能力以及在识别新模式方面的专长也非常显著。ANN能够在不做数据划分因果假设的情况下映射输入和输出过程，作为一种强大的软计算工具，其应用范围已经超越了数据处理和分析，能够有效解决复杂和非线性的问题。

表三 人工神经网络架构模型

 图二 ANN训练Loss展示

      作者在本研究中采用了MATLAB® Neural Network Toolbox来进行人工神经网络（ANN）的建模和优化。研究发现，输入层的神经元数量在逐步增加到10时，能够使ANN达到最佳的学习和泛化性能，这一点从最低的均方误差（MSE）和最高的R2值（如图三）中可以看出。输入层包括标准化的实验输入变量，如作为碳源的糖蜜、作为盐源的KH2PO4和作为氮源的肽腴。基于这些输入因素，输出层的单个神经元预测了脂肪酶生成的输出。隐藏层和输出层的神经元分别采用线性和S型函数激活。

图三 ANN训练结果展示

      作者还强调了ANN在优化过程中的重要性，这一点通过以往类似的实验数据得到验证。所谓的"梯度下降"图（如图四所示），展示了训练过程中模型参数对脂肪酶活性的损失函数变化。训练的目标是最小化神经网络中的损失函数，该函数衡量预测输出与实际目标值之间的不一致性。梯度下降是一种优化技术，用于调整网络的参数（权重和偏差），使损失函数减少。在神经网络中，μ（mu）通常用来表示模型的学习率。学习率是一个超参数，决定了每次优化算法（梯度下降）迭代中沿着负梯度方向的步长大小。学习率影响训练过程的收敛速度和稳定性。μ图会显示不同学习率值对训练过程的影响，可能会展示学习率过低（收敛慢）或过大（振荡或发散）导致网络无法有效学习数据中的潜在模式的情况。找到适当的学习率对成功训练至关重要。另一方面，验证周期图表示了模型在多个训练周期中对验证数据集的性能。

  图四 训练参数训练过程的影响

      综上所述，作者成功地筛选了对脂肪酶活性有显著影响的碳源、氮源和矿物源，并通过RSM和ANN模型优化实现了脂肪酶产量和活性的提高，为发酵工程领域提供了重要的理论依据和实践指导。

      本研究利用人工神经网络（ANN）和响应面法（RSM）优化了脂肪酶的生产参数，取得了显著成果。研究发现，在含有糖蜜、蛋白胨和磷酸二氢钾的培养基中，于37摄氏度下发酵72小时，脂肪酶的产量最高可达29.56 ± 2 U/ml。在实际应用中，B. holotolerans VSH 09表现出卓越的稳定性和兼容性。这一特性使得该新型脂肪酶在可持续燃料领域扮演着重要角色，并强调了其作为工业应用重要生物催化剂的潜力。总的来说，该研究不仅成功提高了脂肪酶的产量，也为其在工业领域的应用提供了有力的理论支持和实践依据。

Hombalimath, V.S., Gurumurthy, D.M. Response surface methodology (RSM) and artificial neural network (ANN) integrated optimization for lipase production by Bacillus holotolerans. Syst Microbiol and Biomanuf (2023). https://doi.org/10.1007/s43393-023-00220-0