巴基斯坦 Muhammad Irfan团队
最新研究成果
Optimization of protease production using Bacillus velezensis through response surface methodology and investigating its applications as stain remover
贝莱斯芽孢杆菌高效生产蛋白酶及其作为洗涤剂的应用
原文链接
https://doi.org/10.1007/s43393-024-00288-2
在当今世界，环境保护和资源的循环利用日益受到人们重视，如何回收利用食品加工业产生的大量蛋壳-蛋膜废弃物的问题就亟待解决。针对这一挑战，作者创新性的利用贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）来以蛋壳和蛋膜粉末为底物来高效生产蛋白酶。作为一种关键的工业用酶，蛋白酶在洗涤剂、食品加工、皮革处理等多个领域扮演着重要角色，所以也响应了工业界对高效、环保的蛋白酶不断增长的需求，但传统的蛋白酶生产方式往往成本高昂，并可能对环境造成负面影响。所以这项研究不仅为解决蛋壳废弃物的再利用开辟了新思路，也为使用廉价底物高效生产蛋白酶的研究提供了参考。作者首先对发酵过程进行了系统优化，首先通过单因素实验确定了最佳培养条件：培养时间72小时，接种量2%，底物浓度1.5%，随后使用Plackett-Burman设计（PBD）从7个营养因素中筛选出显著影响蛋白酶产量的关键因素。为进一步优化关键因素葡萄糖和氯化钙的浓度，作者采用了中心组合设计响应面（CCD-RSM）方法来组合优化这些参数，成功将蛋白酶活性提高到301.0010 U/ml。在酶学特性研究中，作者发现该蛋白酶在45°C、pH 8的条件下活性最高，并在60°C时表现出最佳热稳定性。这些特性使其非常适合应用于洗涤剂行业。值得注意的是，某些金属离子能显著提高酶活性。例如，Cu2+可将蛋白酶活性提高100倍，而Na+、Mg2+和Mn2+也能在不同程度上增强酶活性。为验证该蛋白酶的实际应用价值，作者进行了去污实验。结果表明，该蛋白酶能有效去除血渍、茶渍和墨水渍等顽固污渍，展现出作为环保洗涤剂核心成分的巨大潜力。
研究背景
蛋白酶作为一种多功能酶，在工业和生物技术领域扮演着至关重要的角色，其应用范围涵盖了洗涤剂、食品加工、制药和皮革加工等多个行业。然而，传统的蛋白酶生产方法往往依赖昂贵的培养基和化学原料，不仅成本高昂，还可能对环境造成负面影响。与此同时，食品加工业每年产生大量的蛋壳废弃物，这些废弃物通常被直接丢弃或填埋，造成资源浪费和环境污染。蛋壳含有丰富的矿物质（约93.5%为碳酸钙）和蛋白质（蛋膜中含有472种蛋白质），是理想的发酵底物。近年来，研究人员开始探索利用微生物发酵技术将蛋壳转化为高附加值产品的可能性。其中，芽胞杆菌（Bacillus sp.）因其强大的蛋白酶分泌能力和对环境条件的高适应性而成为研究热点。通过优化发酵条件和筛选高产菌株，科学家们希望开发出一种既能高效利用蛋壳废弃物，又能生产高质量蛋白酶的新方法，从而实现经济效益和环境保护的双赢。这一研究方向不仅有望解决工业蛋白酶生产的成本和环境问题，还为食品废弃物的资源化利用提供了新的思路，对推动循环经济和可持续发展具有重要意义。
科学发现
为研究如何提高B. velezensis生产的蛋白酶的活性，作者对其培养方案中的培养和营养参数进行了优化。首先作者对培养时间进行了比较优化，实验发现了在35°C、120 rpm条件下培养72小时后，蛋白酶活性达到最高（282.67 U/ml）。另外，作者也探讨了接种量对蛋白酶活性的影响，发现使用2%的接种量进行液体发酵效果最佳，蛋白酶的活性也达到了276.26 U/ml。此外在底物浓度的优化中，作者测试了六种浓度，发现在1.5%（w/v）的蛋壳和蛋膜粉末浓度下，蛋白酶活性最高（99.79 U/ml）。
表一 PBD实验中筛选的变量范围及及实验设计
作者随后通过PBD实验优化了蛋白酶的生产条件，其筛选范围与设计变量如表一所示。作者分析实验结果后发现，当葡萄糖浓度为1% (w/v)和CaCl2浓度为0.002% (w/v)时，蛋白酶活性达到最大。作者通过CCD-RSM分析优化了对蛋白酶活性提升最显著的葡萄糖和CaCl2的浓度，以生产更高活性的蛋白酶。
表二 B. velezensis蛋白酶产量最大化的中心组合设计优化
作者在进行的13次实验中，发现第四次实验中观察到最高的蛋白酶活性为301.00 U/ml（表二）。随后作者进一步通过二次多项式回归方程对影响最大的变量葡萄糖（A）、CaCl2（F）进行分析，计算得出方程的多重相关系数R²为0.9853，表明其具有良好的统计意义（表三）。
表三 蛋白酶产量的方差分析(ANOVA)
此外，作者绘制了等高线图和响应曲面图，如图一所示，展示了葡萄糖和CaCl2对蛋白酶生产的作用。此外，作者分析了使用回归方程预测蛋白酶活性与实际活性之间的差异（图二），发现预测值基本符合实际值，进一步证实了葡萄糖和CaCl2是影响蛋白酶生产的最显著因素。
图一 葡萄糖和CaCl2对蛋白酶产量影响的表面图
图二 分析蛋白酶活性与实际测量值的关系
最后，作者对B. velezensis生产的蛋白酶进行了研究，重点考察了温度、pH值和金属离子对酶活性和稳定性的影响，并评估了该蛋白酶的去污潜力。首先，作者研究了温度对蛋白酶活性和稳定性的影响。结果显示，蛋白酶在45℃时表现出最大活性（322.5U/ml），但随着温度的进一步升高，酶活性逐渐下降。然而，在热稳定性分析中，B. velezensis发酵生产的蛋白酶在60℃时活性最高，表明其在50–60℃范围内具有显著的稳定性。接着，作者考察了pH值对酶活性的影响，发现该蛋白酶在pH 8时活性最高（98.71 U/ml）。此外，作者还研究了金属离子对酶活性的影响。实验表明，通过添加Cu2+、Na+、Mg2+和Mn2+等金属离子，可以将蛋白酶活性提高100倍、103倍、115倍和106倍。
最后，作者评估了该蛋白酶作为去污剂的潜力。作者发现仅使用粗酶溶液就能够有效去除血渍、茶渍、永久性墨水和普通墨水污渍（图三），表明B. velezensis生产的蛋白酶具有在洗涤剂中应用的潜力。
图三 测试蛋白酶在去除永久性油墨污渍的表现
总结展望
随着世界对工业绿色生产及可持续发展要求的提升，探索如何利用廉价原料甚至废料来生产高附加值产品日益重要。在本研究中，作者评估了利用Bacillus velezensis以蛋壳-蛋膜废弃物作为底物来生产蛋白酶的潜力。作者通过优化培养时间、接种量和底物浓度下获得了最大蛋白酶产量，并分析发现葡萄糖和CaCl2是影响蛋白酶生产的重要因素。
此外，作者还对该酶的特性进行了分析，结果显示蛋白酶在60℃时具有最高活性，而在45℃、pH 8的条件下，蛋白酶催化效果最好。同时，添加某些金属离子如Cu2+能够显著增强该蛋白酶的活性。其对于常见污渍的清除能力也让作者发现这种以蛋壳-蛋膜作为底物生产的蛋白酶未来具有作为环保洗涤剂成分的潜力。这项研究为利用食品废弃物生产高价值产品提供了新思路。
引用方式
Systems Microbiology and Biomanufacturing(系统微生物学与生物制造，简称SMAB，ISSN：2662-7655) 是由江南大学主办，Springer Nature出版集团出版的英文期刊。期刊SMAB致力于为工业微生物与生物制造过程领域的新发现、新方法和新技术提供报道的平台，由江南大学徐岩教授担任本刊主编，编委分布于全球近20个国家，更多内容详见期刊主页。
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