内生真菌的生物活性研究——系统微生物学与生物制造文章推荐

内生真菌Colletotrichum taiwanense BPSRJ3的生物活性研究

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https://doi.org/10.1007/s43393-024-00276-6

    药用植物中的内生真菌因其产生多种具有生物活性化合物的能力而备受关注，这些化合物具有抗菌、抗氧化、抗癌等药理作用。作者在本研究中从一种药用兰花华丽万代兰中分离并鉴定了其各部位的内生真菌，并评估了其提取物中的化学成分、抗氧化特性、抗菌活性和细胞毒性，并对有前景的真菌提取物进行了代谢物分析。结果显示，C. taiwanense BPSRJ3提取物中总酚和黄酮含量最高，抗菌活性最强，而且对MCF-7和A549癌细胞具有细胞毒性，但对HEK-293正常细胞无毒性影响，具有潜在的抗癌作用。随后作者利用通过FT-IR和GC-MS分析，确定了提取物中的活性成分。这是首次对从华丽万代兰中分离出的C. taiwanense BPSRJ3具有的潜在生物活性进行系统性表征的研究，其结果为该真菌提取物未来在制药领域的应用提供了指导。

      传统上，人类文明重视了解周围植物的药用价值，而这些药用植物的使用方式是人类文化的组成部分，此外丰富的传统草药知识为当代药理学基础提供了支持。药用植物含有多种生物功能的代谢物，研究发现，与人工合成化学物质相比，天然生物活性化合物在治疗中更具优势，因为合成物往往伴随多种副作用。尽管植物是新型医用化学物质的挖掘的重要来源，但其来源限制了某些天然产物的商业应用。因为要获得足够用于治疗的生物活性化合物需要大量植物，而这些植物有时是地方性或受威胁物种，大肆采摘会严重影响生物多样性保护。虽然植物组织培养可以解决这一问题，但其成本高昂。此外，耐药性感染增加和合成药物的不利副作用也提升了对治疗性化合物的需求。因此，亟需发现经济且可持续的生物活性化合物来源，以在不威胁生物多样性的情况下解决人类健康问题。

      内生菌的发现是应对这些挑战的解决方案之一，内生菌是生活在植物组织内而不引起感染迹象的微生物，它们与植物共生，产生增加植物适应性的生物活性化合物，近年来因其能生产与宿主植物相同或相似的生物活性化合物而备受关注。药用植物相关的内生真菌被认为是最有前途的微生物之一，因其多样性和生产多种化合物的能力而著称。这些内生真菌产生的天然产物结构独特、生物活性多样，包括抗氧化、抗菌和细胞毒性。洛伐他汀和紫杉醇等临床重要化学物质的发现，更是开启了内生真菌潜在商业化研究的新篇章，通过发酵过程产业化放大，满足了工业对生物活性化合物的需求，提供了广泛生物活性化合物的发现机会，构成了可持续的天然医用活性物质来源，具有巨大工业应用潜力。

华丽万代兰因其药用价值备受推崇，在其原产地，包括东南亚部分地区和印度，长期用于民间医学，其叶、茎和根均具治疗特性。印度东北部传统上使用其提取物治疗扁桃体炎和发烧，使用其新鲜叶子用作补品和祛痰剂。华丽万代兰在多种草药制剂中被使用，包含生物碱、类固醇、萜类和单宁等多种植物化学物质。先前研究表明，华丽万代兰提取物具有抗氧化特性和对人类癌细胞系的细胞毒性。因此，华丽万代兰作为替代药物资源，是生物勘探内生真菌的优秀候选。目前关于这种药用兰花相关内生真菌生物活性化合物的研究有限，为发现新种真菌及揭示其生物活性潜力提供了新途径。作者在本研究中通过筛选具有抗氧化、抗菌和抗癌等药理活性的真菌提取物，评估了这种药用兰花相关内生真菌的生物活性，进而明确了具有工业应用潜力的候选真菌，对探索与华丽万代兰相关的内生真菌生物活性及鉴定其药用重要性的生物活性代谢物进行了全面且新颖的研究。

    在对内生真菌的分离和鉴定过程中，作者对90个植物片段进行了PDA平板培养，其中23个片段被内生真菌定殖，包括12个根片段、3个茎片段和8个叶片段。根的定殖率最高（40%），其次是叶片（26.67%），最后是茎（10%），整体植物的定殖率为25.56%。总共分离出23株内生真菌。根据其优势、彻底纯化、菌落形态以及显微镜观察结果，作者进一步对五种形态上具有明显差异的分离株（BPSRJ1、BPSRJ2、BPSRJ3、BPSRJ4和BPSRJ5）进行了分子鉴定。

图一 内生真菌分离株的菌落形态镜检

     首先，作者通过对这些分离株的ITS区域序列进行核苷酸BLAST搜索对各分离株进行物种鉴定，结果显示BPSRJ1（从根分离）为Colletotrichum gloeosporioides，BPSRJ2（从根分离）为Daldinia sp.，BPSRJ3（从茎分离）为Colletotrichum taiwanense，BPSRJ4（从叶分离）为Neopestalotiopsis sp.，BPSRJ5（从叶分离）为Apiospora marii。这些序列数据已提交至NCBI GenBank，登录号分别为OM956341、OM956342、OM956343、OM956344和OM956345。随后，作者根据其ITS序列并以酿酒酵母为外群绘制的内生真菌及其最接近同源物的系统发育树见图2。 

图二 系统进化树分析

      作者使用乙酸乙酯对这些内生真菌中的活性物质进行提取，检测到了一系列的植物化学物质（见表三）。作者发现所有内生真菌提取物中均存在生物碱、单宁、多酚和黄酮类化合物，同时Daldinia sp. BPSRJ2、C. taiwanense BPSRJ3和Neopestalotiopsis sp. BPSRJ4的真菌提取物中还检测到了萜类化合物。这些在真菌提取物中检测到的植物化学物质以其重要的药理活性而闻名。比如生物碱已知可以预防微生物感染的风险，单宁表现出抗炎、抗菌、止血和抗氧化活性，萜类化合物具有抗氧化、抗菌和癌症化学预防特性，多酚具有抗氧化和抗转移活性，而黄酮类化合物则是强效的抗氧化剂，具有抗菌、细胞毒性和抗炎作用。

表三 真菌乙酸乙酯提取物的植物化学定性筛选

     作者重点研究了不同真菌提取物的总酚含量和总黄酮含量。实验结果表明，五种真菌提取物中，以C. taiwanense BPSRJ3提取物的总酚含量最高，为30.58 ± 0.39 mg GAE/g（干重），其次为Daldinia sp. BPSRJ2提取物，为5.97 ± 0.40 mg GAE/g（干重），Neopestalotiopsis sp. BPSRJ4提取物为4.49 ± 0.32 mg GAE/g（干重），C. gloeosporioides BPSRJ1提取物为3.67 ± 0.52 mg GAE/g（干重），A. marii BPSRJ5提取物最低，仅为3.47 ± 0.32 mg GAE/g（干重）。而在总黄酮含量方面，结果显示C. taiwanense BPSRJ3提取物同样最高，为2.50 ± 0.02 mg QE/g（干重），最低的是C. gloeosporioides BPSRJ1提取物，仅为0.76 ± 0.02 mg QE/g干重。通过测定粗提取物中的总酚和总黄酮含量，作者推测其具有潜在的良好抗氧化能力，因为酚类和黄酮类化合物都具有潜在的抗氧化作用。

图三 内生真菌提取物的总酚类和总黄酮类物质含量

    于是，作者为明确其抗氧化能力，分别对其进行了DPPH自由基清除试验。所有内生真菌提取物表现出不同程度的DPPH清除活性和IC50值。其中C. taiwanense BPSRJ3提取物的清除活性最高，为75.16 ± 0.18%，IC50值为253.76 ± 16.80 µg/ml，接近抗坏血酸的80.52 ± 0.47%，IC50值为175.32 ± 20.90 µg/ml。A. marii BPSRJ5的清除活性最低，为52.06 ± 0.82%，IC50值为1602.23 ± 0.78 µg/ml。磷钼酸法测得的总抗氧化能力从每克干重提取物13.59 ± 1.43 mg AAE到64.39 ± 0.52 mg AAE不等。C. taiwanense BPSRJ3提取物的总抗氧化能力最高，为64.39 ± 0.52 mg AAE，其次是Daldinia sp. BPSRJ2（27.59 ± 0.43 mg AAE）。同时还原力试验中，C. taiwanense BPSRJ3提取物的吸光值也是最高（1.818 ± 0.018）。

图四 内生真菌提取物的抗氧化试验

     另外，在抗菌活性测试中，作者利用琼脂抑菌圈扩散法发现，内生真菌提取物展示出广谱的抗菌活性，对临床重要的测试病原菌均有显著抑制作用，没有任何一种病原菌对真菌提取物表现出抗性。图四展示了一些代表性的MHA培养皿，其中作者使用了真菌提取物（2 mg/ml）对五种病原菌株进行了测试。在所有真菌提取物中，C. taiwanense BPSRJ3提取物对所有测试病原菌的抑菌圈最大（针对金黄色葡萄球菌为16.67±0.58 mm，枯草芽孢杆菌为17±1 mm，大肠杆菌为18.67±0.57 mm，肺炎克雷伯菌为19.33±0.58 mm，白色念珠菌为19±0 mm）。然而，其他真菌提取物也表现出中等程度的抗菌活性（见表四）。在微量稀释法测试中，C. taiwanense BPSRJ3提取物对革兰氏阴性细菌（大肠杆菌和肺炎克雷伯菌）表现出最低的MIC值（62.5 µg/ml）。对革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）以及真菌（白色念珠菌），台湾曲霉BPSRJ3提取物的最低MIC值为125 µg/ml。A. marii BPSRJ5提取物对金黄色葡萄球菌的最高MIC值为1000 µg/ml。每种真菌提取物对所有测试病原菌的MIC值详见表四。

图四 各真菌提取物的抗菌试验

表四 扩散法测定提取物对受试病原菌的抗菌活性

    最后，基于C. taiwanense BPSRJ3提取物出色的抗氧化、抗菌和细胞毒活性，作者将其进行了生物活性代谢物的表征，采用了傅里叶变换红外（FT-IR）光谱和气相色谱-质谱（GC-MS）分析。C. taiwanense BPSRJ3提取物的FT-IR光谱显示了多种功能基团，包括胺基、醇基、羧酸基和其他功能基团。GC-MS分析检测到了17种主要成分，包括环丙巴比妥、二硫代丙磷酸二十二酯等。这些化合物在已发表的文献中被证实具有多种药理活性，表明C. taiwanense BPSRJ3提取物具有显著的生物活性。

图五 C. taiwanense BPSRJ3提取物的红外光谱分析

      利用传统药用植物寻找新的生物活性内生真菌菌株受益匪浅，因为这些内生真菌产生的代谢产物可能具有药用特性。通过研究民族药用植物中的内生真菌群落，研究人员可以发现新的可能具有治疗作用的生物活性化合物，简化了发现过程，同时也保护了生物多样性。本研究中，作者从华丽万代兰中的不同组织中鉴定出了五种内生真菌物种，并对这些真菌提取物进行了化学分析，检测到生物碱、单宁、萜类化合物、多酚类和黄酮类等物质的存在，表明这些内生真菌可能是重要的植物化学物质的重要来源。此外，作者还测试了真菌提取物具有抗氧化、抗微生物和细胞毒性。总的来说，作者首次报道了从华丽万代兰分离的C. taiwanense BPSRJ3具有潜在的生物活性，可能成为制药领域的生物活性物质生产的未来应用菌株。然而，这些发现需要进一步的研究，包括体内实验、计算建模和临床试验，对药物开发至关重要。

Pun, B., Joshi, S.R. Bioprospection unveils the bioactive potential of Colletotrichum taiwanense BPSRJ3, an endophytic fungus of an ethnomedicinal orchid, Vanda cristata Wall. Ex Lindl. Syst Microbiol and Biomanuf (2024). https://doi.org/10.1007/s43393-024-00276-6

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